В 1339 г., после смерти родителей, Варфоломей раздал большую часть своего имущества бедным и решился всецело посвятить себя Богу. Вместе со старшим братом Стефаном он нашел в десяти верстах от Хотьковского монастыря уединенное место, которое было очень удобно для отшельнической жизни. Вокруг рос густой лес, которого еще никогда не касалась рука человека. С большим трудом братья расчистили делянку, устроили себе сначала шалаш из древесных ветвей, а потом келию. Подле нее поставили небольшую церковь, которую посвятили Пресвятому Имени Живоначальной Троицы. Стефан, не выдержав тяжелой жизни отшельника, короткое время спустя ушел в Москву. Варфоломей же остался тверд в своих замыслах. В 1342 г. он принял пострижение под именем Сергия и начал свой монашеский подвиг.
Твердость его на избранном пути была удивительной. По словам Епифания, с принятием обета, он не только отложил власы со своей головы, но и отсек навсегда всякое свое хотение; совлекая мирские одежды, он в то же время совлекал и ветхого человека, чтобы облечься в нового, ходящего в правде и преподобии истины. Стужу, голод, жажду, изнурительную тяжелую работу — неизменных спутников суровой отшельнической жизни — сносил он с неизменной твердостью и смирением. Кроме хлеба, который время от времени приносил ему из Радонежа младший брат Петр, у Сергия не было другой пищи. Зимними ночами к келий являлись стаи голодных волков, иногда приходил медведь (с ним отшельник из жалости делился своей скудной пищей). Доставалось Сергию и от бесов, которые, по свидетельству того же Епифания, часто принимали образ страшных зверей и отвратительных гадов, чтобы устрашить подвижника. Однажды, когда он молился глухой ночью, они вломились к нему прямо в церковь, но должны были отступить перед его верой и твердостью.
Прошло всего два-три года, и о юном пустыннике заговорили как в Радонеже, так и в соседних селениях. Один за другим жители стали приходить к нему ради духовного совета, а потом нашлись желающие разделить его подвиг. Сергий сначала не соглашался принимать их, но потом, тронутый их мольбами, решил отказаться от своего уединения. Пришельцы построили себе келий, обнесли обитель высоким тыном и стали жить, во всем подражая Сергию. Никакого определенного монастырского устава не существовало, как, впрочем, и самого монастыря. Каждый монах жил отдельно от других, сам добывал себе пропитание и сам вел свое хозяйство. Семь раз в день братья встречались в церкви на молитве. В праздничный день для свершения литургии приглашали священника из ближайшего села. Все свободное от молитвы время монахи проводили в постоянном труде, причем Сергий работал больше всех: он своими руками построил несколько келий, рубил и колол для всех дрова, молол в ручных жерновах, пек хлебы, варил пищу, кроил и шил одежды и приносил воду. По словам Епифания, он служил братии как купленный раб, всячески стараясь облегчить их трудную жизнь. Несмотря на воздержание в пище был он очень силен и необыкновенно вынослив.
Однако такая жизнь не могла продолжаться долго. Когда число монахов умножилось, возникла настоятельная нужда как-то организовать их жизнь, и Сергий в 1354 г. против своего желания принужден был принять священство и был поставлен в игумены. Но и после этого он продолжал учить не столько словом, сколько своим примером. В последующие годы обитель расширилась и приняла вид вполне благоустроенного монастыря. Разбросанные в беспорядке по лесу келий были собраны в правильный четырехугольник и расположены вокруг церкви. Прежняя Троицкая церковь стала тесной. Ее разобрали и поставили на ее место другую, гораздо более просторную. Позже (около 1372 г.) Сергий решился ввести в своей обители общежитие. Это было по тем временам большим новшеством. (Хотя на юге, в Киево-Печерской лавре, общежитие было введено еще святым Феодосием, на севере Руси этот обычай не привился.) Устав, выбранный Сергием, был очень строг: монахам запрещалось иметь личную собственность, и каждый отныне должен был трудиться на благо монастыря. Учреждены были должности келаря, духовника, экклесиарха и другие. С годами местность вокруг становилось все более заселенной.
Вслед за монахами пришло в эти места много крестьян-переселенцев, которые быстро вырубили леса, распахали поля. Затем мимо монастыря была проложена большая дорога в северные города. Обитель Сергиева, по словам Никона, как бы вдруг выдвинулась из дремучих лесов на распутие людской жизни. Но и после этого еще очень долго уделом Сергиевых иноков была самая суровая, ничем не прикрытая бедность. Монахи нуждались буквально во всем: недоставало пищи, одежды, вина для литургии, воска для свеч, елея для лампад (вместо них перед образами зажигали лучины), взамен пергамента для книг употребляли бересту, ели и пили из деревянных сосудов, которые изготавливали своими руками.
В это скудное время, по свидетельству сподвижников Сергия, его молитвами стали совершаться чудеса. Так, например, после горячей мольбы игумена вблизи обители из-под земли пробился обильный источник холодной ключевой воды (до этого братии приходилось с немалым трудом доставлять воду издалека). Затем, благодаря молитвам святого, случилось несколько чудесных исцелений. Слава о Сергии стала греметь по всей округе. К нему потянулись болящие и калеки, и многие после бесед со святым старцем и его молитв испытывали облегчение, а некоторые и вовсе получали полное исцеление. С умножением числа посетителей благосостояние монастыря стало поправляться. Но сам Сергий никогда не имел пристрастия к земным вещам, все раздавая братии или беднякам. До самой смерти он носил сшитую им самим ветхую одежду из сермяжной ткани и простой овечьей шерсти.
Между тем известность его распространилась далеко за пределы Радонежа. Даже патриарх Константинопольский знал о троицком игумене и отправлял к нему свои послания. Для русских людей Сергий был почти что тем же, чем были древние пророки для иудеев. Не только простолюдины, но уже бояре и великие князья искали его советов и благословения. Собираясь в 1380 г. в поход против татар, московский князь Дмитрий Донской посчитал своим долгом посетить по пути Троицкую обитель и принять напутствие от Сергия. Святой старец, предвидя, что грядущая битва закончится гибелью множества воинов, просил Дмитрия не скупиться — послать множество даров хану и тем купить мир. Князь отвечал, что все это он уже сделал, однако враг от его уступок вознесся еще больше. «Если так, — сказал Сергий, — то его ожидает конечная гибель, а тебя, князь, — милость и слава от Бога. Иди, господин, безбоязненно! Господь поможет тебе на безбожных врагов!» Воодушевленный этими пророческими словами, Дмитрий поспешил вдогонку за своим войском. Весть о том, что московский князь получил от святого Сергия благословение на битву, вскоре облетела все войско и вдохнула мужество во все сердца. В день Куликовской битвы 8 сентября все иноки Троицкого монастыря вместе с самим Сергием ни на минуту не прекращали молитвы за русское воинство. Сам Сергий, как повествуют его жизнеописатели, телом стоял в храме, а духом был на поле боя. Он видел все, что там происходит, и как очевидец рассказывал братии о ходе сражения. Время от времени он называл по именам павших героев и сам произносил за них заупокойные молитвы. Наконец, он возвестил о совершенном поражении врагов. Вскоре это пророчество подтвердилось — на обратном пути Дмитрий заехал в Троицкий монастырь и лично сообщил Сергию о своей победе.
После этих событий авторитет Сергия на Руси сделался непререкаемым. В 1385 г., когда между Дмитрием Донским и рязанским князем Олегом разразилась война, великий князь попросил Сергия принять на себя труд миротворца. Поздно осенью Сергий отправился пешком в Рязань и здесь, по свидетельству летописца, кроткими речами много беседовал с Олегом о душевной пользе, о мире и о любви. Под его влиянием Олег переменил свирепость свою на кротость, утих и умилился душой, устыдясь такого святого мужа, и заключил с московским князем вечный мир В последние годы жизни Сергия его духовная сила достигла чрезвычайной мощи. Ему сообщились все дары Божий: дар чудотворения, дар пророчества, дар утешения и назидания. Для его духовного взора не существовало ни вещественных преград, ни расстояния, ни времени.