Захват 5 сентября 1800 года британским флотом стратегически важно расположенного острова Мальта, который Павел I в качестве Великого магистра Мальтийского ордена считал своей территорией, император воспринял как личное оскорбление. 22 ноября (4 декабря) 1800 года российский император издал указ о наложении секвестра на все английские суда во всех российских портах, а также о приостановлении платежа всем английским купцам впредь до расчета их по долговым обязательствам в России, с запретом продажи английских товаров в империи. Дипломатические отношения с Англией были прерваны. Союзный договор между Россией, Пруссией, Швецией и Данией был оформлен в декабре 1800 года. В отношении Англии была провозглашена политика вооружённого нейтралитета. Началась подготовка к заключению военно-стратегического союза с первым консулом Наполеоном Бонапартом. Павел совместно с Наполеоном стал готовить военный поход на Индию, чтобы «тревожить» английские владения. Одновременно с этим он послал в Среднюю Азию войско Донское (22 500 человек), в задачу которого входило завоевание Хивы и Бухары. Это была чистейшей воды авантюра. Столь большое войско гарантированно погибло бы в среднеазиатских пустынях от голода и жажды, как это неоднократно случалось с русскими экспедициями в Хиву. К счастью, казачий отряд был отозван из астраханских степей сразу после гибели Павла. Если бы Наполеон вместе с Павлом отправился покорять Индию, его армию ждала бы неминуемая гибель задолго до 1812 года.
Утеснение дворянства, конфликт с Англией, где российские дворяне покупали основные предметы роскоши, а также переменчивый характер Павла, который мог приблизить к себе человека, а потом почти тут же отправить его в ссылку, привели к тому, что против императора сложился заговор, в котором участвовали офицеры гвардейских полков, расквартированных в Петербурге. Вдохновителем заговора был вице-канцлер граф Никита Панин, которого Павел сначала приблизил к себе, но в середине ноября 1800 года отстранил от должности главы Коллегии иностранных дел (с назначением в Сенат), а в декабре выслал в его имение Дугино. Но в начале 1891 года Панину было разрешено жить в окрестностях Москвы. Реально же заговор возглавил генерал от кавалерии граф Пётр Пален, военный губернатор Петербурга, которому Павел особенно доверял. В последние месяцы царствования Павла Пален также руководил внешней политикой и был генеральным директором почт. Наследник престола, старший сын Павла Александр, будущий император Александр I, был в курсе заговора, но впоследствии утверждал, что не знал о намерении заговорщиков убить отца. Пален поборол его колебания участвовать или не участвовать в заговоре, добившись от Павла письменного повеления арестовать наследника, и показал его Александру. Дворцовый переворот в монархических странах требует непременного участия в заговоре наследника престола, иначе новый монарх всегда сможет казнить заговорщиков за цареубийство. Накануне цареубийства заговорщиками было выпито много вина, и многие выпили более, чем следует; в конце ужина, как говорят, Пален будто бы сказал: «Помните, господа: чтобы полакомиться яичницей, надо прежде всего разбить яйца!» Это расценили как намек на желательность цареубийства.
А вот кто именно совершил его, свидетельства по понятным причинам расходятся, равно как и данные о том, кто именно был при цареубийстве. Заговорщики понимали, что признаваться в убийстве императора не только глупо, но и опасно.
24 февраля (8 марта) 1801 года благодаря интриге Палена имевший большое влияние на императора генеральный директор почт и президент Коллегии иностранных дел Федор Ростопчин попал в опалу у Павла и был удален от двора. Это облегчило осуществление заговора.
Павел умер на том же месте, где родился, поскольку Михайловский замок был возведен на месте деревянного Летнего дворца императрицы Елизаветы Петровны.
В половине первого ночи 12 (24) марта 1801 года 12 заговорщиков ворвались в спальню императора. Их возглавляли бывший фаворит Екатерины князь Платон Зубов, его брат Николай и генерал-лейтенант барон Леонтий Беннигсен, командир Изюмского легкоконного полка. Павел спрятался то ли за занавеской, то ли за каминным экраном.
Не найдя императора в постели, заговорщики растерялись, Платон Зубов сказал, что птичка упорхнула, но «Беннигсен с сатанинским хладнокровием подошел к постели, пощупал её рукою и сказал: “Гнездо теплое, птичка недалеко”». Комнату обыскали и нашли Павла в ночной рубашке (по другой версии, он был уже одет, и его выдали ботфорты). После того как император отказался подписать отречение от престола, началась потасовка, во время которой император был убит. Смерть последовала то ли от удара табакеркой в висок, то ли от удушения офицерским шарфом. Павел был убит между 0.45 и 1.45. Кто именно нанес удар табакеркой, принадлежавшей Николаю Зубову, а также кто душил императора шарфом, принадлежавшим то ли штабс-капитану Измайловского полка Якову Скарятину, то ли самому Павлу, достоверно установить невозможно из-за противоречивых показаний мемуаристов, каждый из которых стремился доказать, что сам убийство не совершал и либо вышел из спальни еще до убийства, либо, признавая, что остался в комнате, имя убийцы не называл или указывал в этом качестве на кого-то другого.