В начале 1935 года Алексей Иванович Маркушевич становится старшим научным сотрудником НИИ механики и математики Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, а в 1938 году — доцентом университета, в котором начал преподавание с 1935 года.
Не оставляя преподавание в МГУ, А.И. Маркушевич с 1940 года на постоянной основе работал в Калининском государственном педагогическом институте (ныне — Тверской государственный университет). Двое из подготовленных им в этом вузе кандидатов наук — Н.А. Давыдов и В.И. Никольский — в дальнейшем были в числе руководителей тверской школы по теории приближений и экстремальных задач.
В годы Отечественной войны Алексей Иванович выполнял большую работу, заведуя учебной частью Московского государственного университета. В то же время он вёл и интенсивные научные исследования. Интересы А.И. Маркушевича в это время смещаются в сторону изучения общих подходов к теории аппроксимации, интерполяции и разложения функций в ряды. Алексей Иванович одним из первых в мировой науке систематически применил к изучению семейств аналитических функций методы теории линейных топологических пространств. Он указал общий критерий полноты системы аналитических функций, из которого как частный случай вытекали многочисленные специальные теоремы, полученные другими авторами, причём в улучшенном и обобщённом виде. Алексей Иванович дал законченную формулировку в виде критерия двойственности связи между полнотой систем и единственностью аналитических функций.
Используя свои общие идеи в теории интерполяции и аппроксимации функций, Алексей Иванович получил ряд весьма глубоких конкретных результатов. Этот цикл исследований составил содержание докторской диссертации А.И. Маркушевича «Некоторые вопросы теории приближения и разложения функций в ряды», которая была защищена в апреле 1944 года в Московском государственном университете.
А.И. Маркушевич выполнил также небольшой, но весьма интересный цикл исследований по обобщениям теории аналитических функций. В работе «О некоторых классах непрерывных отображений» (1940) он, развивая идеи Г. Греча и М.А. Лаврентьева, вводит класс локально однолистных отображений л-мерного евклидова пространства, которые почти в каждой точке области своего определения обладают в некотором смысле ограниченным искажением. Широкое понимание ограниченности искажения, принятое Алексеем Ивановичем, в последующие годы послужило основой для плодотворного обобщения понятия квазиконформного отображения, развитого в работах И.Н. Песина, П.П. Белинского и Б.В. Боярского.
К этому же направлению примыкает работа А.И. Маркушевича «О продолжении по непрерывности», в которой он, с весьма общей точки зрения и для весьма широкого класса функций, изучил вопросы продолжения по непрерывности, навеянные теорией аналитического продолжения, а также работа, в которой Алексей Иванович обобщает теорию неопределённого интегрирования на решения некоторых линейных систем уравнений с частными производными. Последнее исследование нашло многочисленные отклики, как у нас, так и за рубежом.
В 1958 году в связи с 50-летием А.И. Маркушевича коллеги писали о нём, что он «принадлежит к числу тех больших учёных, чьи работы открывают новые пути в развитии науки и во многом предопределяют это развитие. Так, широкое использование в теории аналитических функций методов функционального анализа и, в частности, теории линейных пространств, ведущее начало от цикла работ Алексея Ивановича по вопросам приближения, интерполяции и полноты, стало к настоящему времени одной из наиболее интенсивно разрабатываемых ветвей теории функций. Такое же развитие нашли идеи, высказанные Алексеем Ивановичем в его работах по обобщениям теории аналитических функций. Алексей Иванович встретил своё пятидесятилетие в полном расцвете творческих сил, и хочется пожелать ему найти в теории функций ещё много новых непроторенных путей».
Математические интересы А.И. Маркушевича не исчерпываются перечисленными проблемами. Он написал интересные работы по теории граничных свойств аналитических функций — такие, как «Об одной граничной задаче теории аналитических функций», «Несколько замечаний об интегралах типа Коти», «Некоторые вопросы теории граничных свойств аналитических функций», по некоторым вопросам анализа, а также по приложениям теории функций к гидродинамике.