У некоторых культиваторов практически не возникает проблем, при том что они работают в, казалось бы, совсем примитивных условиях (быстрые движения натренированных рук и понимание сути действий позволяют достичь очень высокого уровня стерильности — прим. ред.). Другие испытывают явные проблемы с постоянными заражениями и им приходится вкладываться в высокотехнологичные устройства контроля окружающей среды. Каждые конкретные условия вынуждают принимать определённые контрмеры. И независимо от того выращиваете ли вы грибы дома или организовываете работу лаборатории, вы испытаете одинаковые трудности отличающиеся лишь в масштабах.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ АГАРА
Завершив обустройство стерильной лаборатории следующим шагом можно приступать к приготовлению питательного носителя на основе агара. Агар — это вырабатываемое из морских водорослей студнеобразующее вещество, наподобие, но несколько более эффективное, чем желатин. Существует много рецептов приготовления обогащённых агаровых носителей пригодных для разведения грибной культуры. Стандартными можно считать картофельный (Potato Dextrose Agar (PDA)) и солодовый (Malt Extract Agar (MEA)) агары, которые нередко дополняют дрожжами в качестве питательной добавки. В микологических журналах часто упоминаются агары на пептоне и неопептоне — два самых доступных источника протеина для грибного мицелия. Есть ещё один тип агара, который авторы рекомендуют, на бульоне от варки ржи или пшеницы с добавлением солодового сахара (или мальтоза — дисахарид, образованный двумя остатками глюкозы).
Если вы испытываете трудности связанные с инфицированием бактериями, то добавление антибиотиков в питательный носитель предотвратит их размножение. Большинство антибиотиков, таких как стрептомицин, разрушаются в процессе автоклавирования и, поэтому их следует добавлять в агар после стерилизации, пока он жидкий. Один антибиотик, сульфат гентамицина, выдерживает автоклавирование и эффективен против широкого круга бактерий. Антибиотики негативно влияют на мицелий некоторых видов грибов.
Десятки обогащённых агаровых сред были успешно использованы для культивации грибов и у каждого грибовода складываются свои предпочтения основанные на личном опыте. Независимо от типа используемой агаровой среды, важнейшей её характеристикой является pH — логарифмическая шкала, отмечающая уровень кислотности или щёлочности в диапазоне от 0 (кислота) до 14 (щелочь), где 7 нейтральный уровень. Различные виды Psilocybe предпочитают носитель сбалансированный между 6,0–7,0, тогда как Agaricus brunnescens и близкие к нему лучше растут в нейтральной среде. По большей части мицелий достаточно терпелив и хорошо растёт в промежутке 5.5–7.5 pH. О показателе pH стоит беспокоиться только тогда, когда на носителе не прорастают споры или рост мицелия чрезвычайно замедлен (придется запастись лакмусовыми бумажками для оценки pH — прим. ред.).
Ниже приведены несколько формул сбалансированных питательных сред обогащённого агара, в высшей степени пригодных для выращивания мицелия видов Agaricus, Pleurotus, Lentinus, Stropharia, Lepisia, Flammulina, Volvariella, Panaeolus и Psilocybe. Из приведённых формул авторы предпочитают две: PDY (картофельный с декстрозой и дрожжами — Potato Dextrose Yeast) и MPG (зерновой с солодом и пептоном — Malt Peptone Grain) агаровые составы. Добавлением в любому составу молотой ржи или зернового экстракта можно добиться преобладающего роста нитевидного мицелия, т. е. наиболее предпочитаемого за его быстрый рост.
Выберите формулу, смешайте ингредиенты в сухом виде, поместите всё в мерную чашку и добавляйте воду пока не получите литр состава (дайте агару набухнуть перед стерилизацией — прим. ред.).
PDY (картофельный с декстрозой и дрожжами) агар
300 гр картофеля кипятить час в литре воды, отфильтровать
10 гр декстрозы (глюкозы)
2 0 гр дрожжей 2 0 гр агара
МЕА (агар на солодовом экстракте)
20 гр желто-коричневого солода 2 гр дрожжей (по усмотрению)
20 гр агара
(избегайте использования тёмного пивного карамелизованного солода, требуемый солод именно светлого, слегка подрумяненного цвета, более сыпучий и нелипкий)
MPG (агар зерновой с солодом и пептоном)
20 гр желто-коричневого солода 5 гр молотых зёрен ржи
5 гр пептона или неопептона
2 гр дрожжей (по усмотрению)
20 гр агара
(Прим. ред.: Если агар не удастся достать или купить, например, у китайцев, то можно попробовать взять цветной мармелад. Его следует измельчить и отмыть от всех пищевых добавок, выдерживая в воде несколько дней, периодически, несколько раз в день, меняя воду. Затем высушить.)
Для задерживания роста бактерий на каждый литр воды до стерилизации можно добавлять 0,1 гр 60–80 % сульфата гентамицина (см. Приложение VII).
Качество воды, её pH и минеральный состав отличаются в зависимости от региона. Если качество вашей воды находится под сомнением, рекомендуем использовать дистиллированную воду. Для практических нужд, тем не менее, сгодиться и вода из водопровода, без особого вреда для мицелия. В некоторых случаях сбалансированный уровень pH важен, например, для проращивания спор или разведения мицелия экзотических видов грибов. Изменить pH носителя можно добавляя в него по капле соляной кислоты (HCL) или каустическую соду (NaOH) (вероятно сойдет уксус и пищевая сода — прим. ред.). Затем основательно перемешав состав, нужно снова измерить его уровень pH. (pH соляной кислоты — 0; pH каустической соды — 12; pH дистиллированной воды — 7).
Тщательно смешав все ингредиенты стерилизуйте состав в скороварке в течении 30 минут при давлении в 1,05 атм (15 psi).
(Скороварка является безопасным и эффективным средством стерилизации субстратов при условии использования строго в соответствии с инструкцией производителя — многие производители настолько помешаны на безопасности скороварок, что из-за всех их причиндалов, их скороварки вообще никуда не годятся, но изображенная на фотографии является неплохой — прим. ред.). Для автоклавирования агара рекомендуем использовать колбу с узким горлом. Если у вас нет специально приспособленного для этого сосуда, подойдёт любая похожая по форме бутылка.
Обязательно заткните горлышко ватным тампоном и прикройте сверху фольгой до помещения в скороварку.
Колбу можно наполнить только на 2/3-3/4 от полного объёма.
Наполненный сосуд поместите в скороварку налив достаточное для образования пара количество воды. (Обычно достаточно 1 см от дна). Приведите скороварку в рабочее состояние следуя инструкции производителя. Поставьте её на огонь и дождитесь появления густой струи пара. Выждав 4–5 минут закройте паровой клапан. Медленно поднимите давление до 1,05 ат (15 psi) и поддерживайте его в течении получаса. Не позволяйте температуре подниматься выше 121 °C, в противном случае сахар в агаровой среде карамелизуется. Карамелизованный сахар в носителе подавляет рост мицелия и повышает вероятность генетических мутаций.
В лаборатории следует иметь стерильную тряпичную ухватку или кусок свежевыстиранной ткани для удобства обращения с горячей посудой с агаром.
Время необходимое для стерилизации разнится в зависимости от высоты над уровнем моря. В неизменном объёме существует прямая зависимость между давлением и температурой (известная как закон Бойля-Мариотта). Когда рекомендуется определённое давление (равно как и температура), оно основано на стандартной высоте над уровнем моря. Культиваторам, проживающим в местах расположенных значительно выше уровня моря (например на Эвересте — прим. ред.), придётся стерилизовать дольше и при более высоком давлении, чтобы достигнуть того же эффекта. Ниже приведена сокращённая таблица, показывающая зависимость между давлением и температурой, и изменение температуры закипания воды на различных высотах. Увеличивайте рекомендованное давление исходя из температуры кипения воды зависящей от вашего положения над уровнем моря. К примеру на высоте в 1,5 километра температура кипения воды снизится приблизительно на 5,5 °C. Это значит что давление необходимо увеличить до 1.4 ат (20 psi), т. е. на 0,35 от рекомендуемых 1,05 ат (15 psi). Смотрите в таблице требуемое давление при изменении температуры на 5 °C. (На самом деле температура остаётся прежней, а вот давление изменится).