http://sci.aha.ru/ALL/bl7.htm — зависимость температуры кипения воды от давления
Заметьте что эффект стерилизации получаемый при кипячении в течении 60 минут с давлением в 1,05 атм (15 psi) будет таким же от 30 минут с 2.1 ат (60 psi). Таким образом увеличение давления вдвое сократит время стерилизации вполовину. Но большинство скороварок не могут работать с таким давлением. Ещё некоторое время всё-таки стоит прибавить для достаточно хорошего проникновения пара в субстрат, особенно если используется большой и плотно Загруженный автоклав (Прим. ред.: Не морочьте голову, большинство скороварок рассчитано на 1 атм давления пара. Если стерилизуемое богато микрофлорой и спорами, то следует стерилизовать 1,5 часа. Если стерилизуемое нестойко к температуре — то 15 мин. В остальных случаях 30–60 мин.).
После стерилизации поместите скороварку в лабораторию или комнату с условиями близкими к стерильным и, до того как откроете, дайте давлению в ней выровняться с атмосферным (то есть дайте остыть немного, а то при открывании все закипит; наличие давления можно проверять, слегка открывая клапан скороварки — прим. ред.). Одним литром агара можно сполна залить 30 чашек Петри размером 100 х 15 мм. Способы разлива агара отличаются от грибовода к грибоводу. Если нужно разлить только одну или две стопки по десять чашек, их можно разложить на рабочем столе все рядом. Если необходимо приготовить больше чем две стопки или поверхность рабочего стола ограничена, тогда более удобно будет разливать, перемещая чашки из стопки в стопку.
Прим. ред.:
При работе со спиртовым факелом (даже не в боксе), его в этом случае нужно создавать на металлической крышке от какой-либо банки. Простерилизованную чашку Петри нужно ставить на какую-нибудь более высокую металлическую банку (из-под растворимого кофе, например), как можно ближе к факелу, чтобы поднимающий над пламенем горячий стерильный воздух не давал возможности приблизится к чашке спорам и микроорганизмам, содержащимся в воздухе помещения. Свежевымытые, и еще слегка влажные, чашки Петри стерилизуются в скороварке. Для стерилизации их обычно заворачивают в плотную (от бумажных мешков) бумагу, несколько штук в одну упаковку. Поставьте в скороварку какую-нибудь подставку, чтобы упаковка не намокала. Конечно, речь идет о стеклянных чашках Петри. Пластмассовые, как правило, одноразовые, уже стерильны. Последние пригодны для работы только в ламинарных боксах.
Пробирки достать легче, чем чашки Петри. Лучше ориентироваться на них. Пробирки закрываются ватными пробками. Для изготовления ватных пробок, разложите вату слоем, слегка обрызгайте водой и скатайте в плотный рулон. Обычно из рулона можно нарезать несколько, 2–4, пробок. На каждую натяните кусок марли, завяжите ниткой или тонкой бечевкой. Лишний хвостик марли удалите, он может вспыхнуть в пламени. После этого пробки нужно высушить каким-либо способом, иначе они могут заплесневеть. Или же только подсушить и сразу простерилизовать их. Пробирки стерилизуются также как чашки Петри. Чтобы пробки не намокали — верх каждой пробирки оборачивают плотной бумагой и обвязывают тонкой бечевкой или резинкой. Некоторые используют толстую фольгу. Многие помещают пробирки в скороварку для стерилизации в самодельном ведерке, сделанном из какой-либо металлической банки.
Если же не будет даже пробирок, то попробуйте использовать какие-нибудь маленькие бутылочки. Работать с ними хуже, стекло не термостойкое, при работе может пойти трещинами.
Перед разливом энергично взболтайте колбу с расплавленным агаром для равномерного распределения питательных веществ. Опытные культиваторы наполняют чашки в темпе и без перерывов. Если разливаемый агар всё ещё очень горячий, на крышке чашки Петри может образоваться конденсат. Чтобы уменьшить количество конденсата, можете подождать некоторое время, перед тем как разливать агар. Если после того как давление выровняется скороварка постоит ещё 45 минут, то посуду с жидким носителем можно будет брать в руки не опасаясь обжечься.
От выбранного гриба можно получить два типа культуры: произвести новый мицелий из спор или клонировать живую ткань гриба (рекомендуем последний, как более стерильный — прим. ред.). Каждый из способов даёт в результате жизнеспособный мицелий. У обоих способов есть свои преимущества и недостатки. Большинство грибоводов начинают культуру из спор. Преимущество использования спор заключается в том, что они сохраняют всхожесть от недель до месяцев, после того как плодовое тело произведшее их разложилось. Другой путь получения культуры — вырезать кусочек ткани из внутренней части живого образца (на свежем, то есть стерильном, изломе — прим. ред.), в сущности клонировав его. Образец ткани для культуры необходимо взять в течение одного или двух дней, после того как гриб был сорван, иначе с каждым днём будет всё труднее получить здоровый клон мицелия (тем не менее удавалось клонировать грибы, купленные в магазине — прим. ред.).
ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУРЫ ИЗ СПОР
Получение спорового отпечатка
Для того чтобы собрать споры отделите шляпку от ножки свежего, хорошо очищенного гриба и положите её пластинками вниз на лист чистой белой бумаги
Шили на чистую стеклянную поверхность, типа предметного стекла для микроскопа. Если шляпка частично высохла, добавьте каплю чистой воды для облегчения спороношения. Для уменьшения высыхания за счёт испарения и защиты от воздушных потоков накройте шляпку гриба чашкой или стеклом. Через несколько часов споры упадут в соответствии с радиальной симметрией гимениальных пластинок. Если вы использовали бумагу, вырежьте отпечаток, сложите пополам, положите в воздухонепроницаемый контейнер и надпишите дату, вид и номер сбора (или чашку Петри — прим. ред.). Если использовалось предметное стекло, то споры можно накрыть таким же стеклом и обернуть плёнкой во избежание проникновения спор контаминантов. Неаккуратно взятый или хранимый отпечаток, будет инфицирован (в этом и проблема — прим. ред.) и шансы на получение чистой культуры из него резко упадут.
Agaricus brunnescens, Psilocybe cubensis и многие другие виды грибов обладают частичной вуалью — тонким слоем ткани растягивающимся от краёв шляпки к ножке. Вуаль может помочь в получении спор почти свободных от контаминантов. Вуаль прикрывает пластинки снаружи, создавая практически стерильные условия внутри и споры можно получить не сильно опасаясь заражения. Выбрав молодой и здоровый образец с сохранившейся вуалью и затем убрав её в асептических условиях, можно получить практически чистый споровый отпечаток. Это идеальный путь для начала мультиспоровой культуры.
Способы проращивания спор
Получив отпечаток, можно начинать производство грибной культуры. Простерилизуйте инокуляционную петлю или скальпель поместив его в пламя спиртовки или бутановой горелки на пять или десять секунд, пока он не разогреется докрасна. (Если используется бутановая горелка, приберите её пламя до минимума, чтобы минимизировать перемещение воздушных потоков). Охладите скальпель, поместив его кончик в стерильную среду в чашке Петри, и затем соскребите немного спор с отпечатка. Перенесите их на агар проведя по его поверхности скальпелем. Подобного результата можно добиться потерев скальпелем по отпечатку, так чтобы споры сами упали в открытую чашку Петри (на снимке, вместо чашки Петри, используется подходящая банка — прим. ред.). Начиная культуру со спор, желательно заразить как минимум три чашки с агаром, чтобы получить хорошие шансы на всхожесть. Мицелий выращенный таким образом называется мультиспоровой культурой.