С этого момента банки содержат в себе «мастер-культуру» и вы должны сделать всё возможное, чтобы гарантировать высочайший уровень её чистоты.
Авторы рекомендуют использовать технику «двойного ломтика», в которой исходный треугольник разрезается ещё на две части, и будучи насаженными на скальпель переносятся в ожидающую банку со стерильным зерном. Банки инокулированные данным методом зарастают гораздо быстрее, нежели при переносе целого ломтика.
Ослабление крышки банки перед инокуляцией облегчает быструю пересадку. По мере завершения каждого переноса с агара на зерно, закрывайте крышку и переходите к следующей инокуляции. Обработав таким образом всю партию, плотно заверните крышки и тщательно встряхните каждую банку для равномерности распределения ломтиков с мицелием. В ходе тряски ломтики перемещаются через массу крупы оставляя везде фрагменты мицелия прилипающие к зёрнам. Если ломтик прилипнет к стеклу, распределение затруднится и распространение мицелия задержится. Данная проблема указывает на то, что агар был налит в чашки слишком тонким слоем или пересушен. Встряхнув, инкубируйте грибницу в банках при температуре свойственной виду (повторное перетряхивание может потребоваться на 4-й или 5-й день). Чаще всего мицелий должен полностью колонизировать банки за 7-10 дней.
Прим. ред.: Техника показанная на снимках, подходит для работы в стерильном микробиологическом боксе или ламинаре, но совершенно не годится, когда нет такого оборудования. Причины:
1. путь движений с мицелием слишком длинен, обязательно попадут какие-нибудь микроорганизмы.
2. Нет ничего, убивающего все падающие споры и микроорганизмы.
Хорошая идея заключается в том, чтобы поставить горящий спиртовый факел, пространство над ним, и до некоторой степени вокруг, стерильно. Горячий воздух поднимается вверх, недавая оседать пыли и микробам. Соответственно банка и чашка Петри (или пробирка в руке) должны быть придвинуты к самому факелу, причем чашка Петри должна быть расположена повыше, на какой-нибудь подставке (жестяной банке).
Через 2–3 дня после инокуляции, (если инокуляция прошла успешно), кусочек агара начнет обрастать пухом мицелия, а в местах соприкосновения с зерном мицелий начнет перебираться на субстрат. Мицелий растет довольно быстро и с каждым днем осваивает все большую поверхность субстрата, перебираясь по зернам и образовывая полностью заросшие участки.
Как только мицелий начал активно распространяться по субстрату, и появились полностью обросшие участки из нескольких зерен, субстрат можно "перетряхнуть". Во время перетряхивания, обросший мицелием участок субстрата разбивается на отдельные зерна, которые, попадая в новые места, образуют сразу несколько новых очагов развития мицелия — это существенно сокращает время освоения мицелием субстрата, и способствует более равномерному его зарастанию.
Но, поскольку большая часть зерна еще не обросла мицелием и риск ее заражения еще слишком велик, перетряхивать субстрат следует очень аккуратно. При перетряхивании, нужно следить за тем, чтобы зерно как можно меньше касалось крышки банки и самого тампона. В этих местах могут находиться посторонние микроорганизмы, пробравшиеся "из вне", которые могут привести к заражению субстрата. Следует не "трясти" банку из стороны в сторону, а удерживая её в одной руке, другой рукой наносить удары по нижней части банки. Таким образом, субстрат будет перемешиваться внизу банки, почти не попадая в ее верхнюю часть. Сразу после перетряхивания субстрата, зёрна обросшие мицелием теряют свою "пушистость" и их практически невозможно отыскать в общей массе.
Но уже через 1–2 дня на некоторых зёрнах, становятся видны белые точки мицелия, которые быстро увеличиваются в размере и, перебираясь на соседние зерна, завоевывают новые территории. Через несколько дней, мицелий разрастается по субстрату и снова образовывает полностью заросшие участки. Когда это произошло, перетряхивание субстрата следует повторить. С каждым новым перетряхиванием субстрата, очагов развития мицелия становиться все больше. И зарастание происходит все быстрее. Для полного обрастания субстрата мицелием, обычно требуется 3–5 недель, в зависимости от температуры окружающего воздуха. Чем меньше остается неосвоенного мицелием субстрата, тем меньше риск его заражения при перетряхивании. Но все равно, перетряхивать субстрат следует как можно аккуратней, т. к. если заражение все-таки произойдет, субстрат придется выбросить, а банку придется заново стерилизовать. И будет очень обидно, если это случиться уже в самом конце колонизации субстрата.
Если заражение субстрата все же произошло, субстрат из этой банки необходимо выбросить. Некоторые виды плесени содержат токсины и могут быть очень опасны для здоровья человека. Поэтому зараженный субстрат проще выкинуть и приготовить все заново.
Нормальный цвет мицелия — белый, допускаются лишь белый цвет с легким голубоватым или желтоватым оттенком. Нормальный запах мицелия — грибной, но запах мицелия практически не чувствуется, его можно почувствовать либо сразу после перетряхивания субстрата (уже на завершающей стадии, когда почти все зерно обросло мицелием), либо при перекладывании субстрата из банки в контейнер. Все другие цвета и запахи — признак заражения субстрата. На снимке справа показано как выглядит полностью обросшее мицелием зерно.
Инокуляция зерна мастер-культурой
Будучи полностью колонизированными эти мастер-банки могут быть использованы для дальнейшего производства зерновой грибницы в литровых или 2-х литровых контейнерах. Пересадку мастер-культуры следует произвести в течении нескольких дней после полной колонизации банок, в противном случае могут возникнут трудности с разделением грибницы на отдельные зёрна. Ниже приведено пошаговое описание техники пересадки с зерна на зерно:
1. Тщательно исследуйте каждую банку на наличие признаков заражения. Обратите внимание на следующие отклонения: слишком плотное зарастание; участки со слабым или подавленным ростом; зёрна покрытые слизью или выглядящие мокрыми (признак бактериального заражения); лопнувшие зёрна с мертвенно-бледной, неровной поверхностью; и любые необычные оттенки цвета. В случае возникновения сомнений слегка приподнимите крышку и понюхайте грибницу — кислый запах «гнилого яблока» или же сильный душок обычно являются признаками бактериальной деятельности или заражения плесенью. От банок с таким ароматом следует избавиться. (Иногда банки только частично поражённые бактериями можно использовать для плодоношения, нанеся покровный слой). Никогда НЕ используйте подозрительные банки для последующих инокуляций.
2. Выбрав самые красивые банки с мастер-грибницей, разбейте мицелий ударяя банки о шину или похлопывая ладонью. Грибница должна легко разделиться на отдельные зёрна. Встряхните столько мастер-банок сколько вам может потребоваться, учитывая что каждой из них вполне достаточно для инокуляции от десяти до двенадцати литровых или от семи до девяти двухлитровых банок. Перетряхнув, ПОСТАВЬТЕ ЭТИ БАНКИ С ГРИБНИЦЕЙ НА ОТДЕЛЬНУЮ ПОЛКУ И ВЫЖДИТЕ ОТ ДВЕНАДЦАТИ ДО ДВАДЦАТИ ЧЕТЫРЁХ ЧАСОВ ДО ПОСЛЕДУЮЩЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ. Этот период выжидания очень важен, т. к. в некоторых из них грибница не сможет развиваться дальше, обычно по причине бактериального заражения. Если бы эти банки были использованы для дальнейших пересадок, заражение разнеслось бы ещё на десять банок.
3. Повторно проинспектируйте банки на признаки контаминации. После 12 ч или суток мицелий снова покажет признаки роста.
4. Если вы перетряхнули мастер-банки вечером, то наутро уже можно приступать к инокуляции или как только остынут новые банки с зерном (второе поколение, G-2). Опять, вымойте лабораторию, проведите комплекс мер в рамках личной гигиены и наденьте свежевыстиранную рабочую одежду.