Микроклубни хранят в холодильнике при температуре +2 +5 °C и влажности воздуха до 95 %. Их закладывают в стерильные пробирки без среды по 10 штук в каждую и закрывают пробками (срок хранения до 6 месяцев). Таким образом, создаются условия, соответствующие периоду покоя картофеля, что способствует лучшей всхожести и жизнеспособности растений.
Весь период от микрочеренкования до получения микроклубней составляет 60–65 дней.
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, пробирки с питательной средой для получения микроклубней, пробирки со стерильными проростками, имеющими 5–6 сформированных листьев, флаконы с 96 % спиртом для стерилизации инструментов, скальпели, пинцеты, препарировальные иглы, спиртовка, вата, стерильные чашки Петри.
Ход работы.
1. В стерильных условиях, стерильными инструментами извлечь проростки с хорошо сформированными корнями из пробирок и перенести на питательные среды для индукции клубнеобразования.
2. Пробирки с пересаженными в них растениями закрыть и перенести в культуральную комнату.
3. Провести наблюдение процесса клубнеобразования через 4-6-8 недель культивирования.
4. Результаты зарисовать, сделать выводы на основании теории гормональной регуляции.
5. Заложить микроклубни на хранение.
Работа 5. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ. ТЕСТИРОВАНИЕ РАСТИТЕЛЬНОГО МАТЕРИАЛА НА СОДЕРЖАНИЕ ВИРУСОВ
Объяснение. Принцип метода ИФА заключается в следующем: к одному из компонентов антиген-антитело присоединяют фермент, другой компонент сорбируют на твердой фазе. Затем проводят реакцию нейтрализации, добавляют субстрат и определяют активность комплекса. Активность фермента, то есть количество образовавшихся комплексов антиген-антитело пропорционально содержанию вирусов.
Для анализа используют полистероловые плата, в лунки которых добавляют сыворотку и антитела, полученные на основе тестируемых вирусов из крови млекопитающих.
Антитела адсорбируются на поверхности ячеек плата в течение 6 часов. Остатки сыворотки удаляют специальным буфером. Затем в лунки вносят исследуемые вытяжки растений (сок листьев, клубней). При наличии вирусного заражения образуется комплекс вирус-антитело. Обязательно готовят контрольные плата (без заражения). После промывания буфером в ячейки добавляют антитела в комплексе с ферментами: фосфотазой и пероксидазой. В присутствии вируса на поверхности плата образуется комплекс антиген-антитело-фермент. Если материал стерилен, комплексы не образуются, а остатки фермента отмываются буфером. После всех описанных выше манипуляций в лунки плата добавляют субстрат, на котором работает фермент (для фосфотазы необходимы эритроциты крови, которые разрушаются в ее присутствии).
В результате реакции между ферментом и субстратом окраски растворов в лунках плата изменяются в зависимости от степени заражения вирусом: нет окраски — «-» — вирус отсутствует, светло-коричневая окраска — «+» — среднее заражение вирусом, ярко-коричневая окраска — «++» — высокая степень заражения вирусом.
Для успешного тестирования вирусов необходимо создать стандартные условия, использовать высококачественные антитела, ферменты, плата.
Материалы и оборудование. Полистероловые плата, растительные вытяжки, гомогенизатор, сыворотки, растворы ферментов, кровь млекопитающих, буферный раствор, центрифуга, растительный материал.
Ход работы.
1. Растительный материал гомогенизируют и центрифугируют.
2. Заполнить сывороткой полистероловые плата и оставить для инкубации на 6 часов.
3. Промыть плата буфером.
4. Внести в лунки плата центрифугат и оставить для инкубации на 1 час.
5. Промыть плата буфером.
6. Заполнить плата сывороткой с ферментом и оставить на 1 час.
7. Промыть плата буфером.
8. Внести в лунки субстрат для фермента.
9. Протестировать изменение окраски в лунках плата по шкале.
10. Отобрать образцы без вирусов, со слабой степенью заражения и с сильным заражением вирусом.
11. Результаты тестирования зарисовать, сделать выводы о качестве посадочного материала.
Работа 6. ПОЛУЧЕНИЕ БЕЗВИРУСНОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА МЕТОДОМ ТЕРМОТЕРАПИИ В СОЧЕТАНИИ С КУЛЬТИВИРОВАНИЕМ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ
Объяснение. В случае заражения посадочного материала вирусами применяют термотерапию. Предварительно клубни без бактериальных и грибковых инфекций тестируют ИФА. Затем их размещают в кюветах со стерильным песком и проращивают 1–2 недели при температуре 28–30 °C, 4 недели при температуре 37–38 °C и влажности воздуха 70–80 %. Дважды в день песок увлажняют, через 7-10 дней проводят подкормку раствором Кнопа и микроэлементов по прописи Мурасиге-Скуга: 5 мл маточного раствора на 1 л раствора Кнопа. Клубни жаровыносливых сортов можно сразу выращивать при температуре 37–38 °C и влажности воздуха 70 %.
Режим тепловой обработки для каждого сорта подбирают экспериментально.
В случаях заражения растений мозаичными, веретеновидными, нитевидными, палочковидными вирусами термическая обработка малоэффективна. Поэтому дополнительно используют биотехнологические методы: метод апикальных меристем. Для этого перед термообработкой верхушки растений картофеля срезают и помещают на 5 часов в раствор гетероауксина (50 мг/л). Укорененные проростки помещают в культуральные камеры или комнату с температурой воздуха 37 °C, почвы — 30–32 °C, с фотопериодом 16 часов на 4–6 недель.
Термообработку обычно проводят осенью и зимой. Весной из растений вычленяют пазушные почки от 0,3 до 1 мм и высаживают на питательные среды (МС без гормонов, pH 5,7).
Материалы и оборудование. Клубни картофеля, кюветы с песком, флаконы с водой, кюветы с проращенными и прошедшими термотерапию растениями, ламинарбокс, бинокулярный микроскоп МБС-9 или МБС-10, стерильные скальпели, препарировальные иглы, флаконы с 96 % спиртом, хлорамином, спиртовки, пробирки с питательными средами.
Ход работы.
1. Здоровые клубни картофеля тщательно промыть проточной водой.
2. Клубни обработать стерилизующим раствором (спирт, хлорамин), про мыть проавтоклавированной водой.
3. Вырезать глазки с частью паренхимы (1,5 х 1,5 см) и поместить в кюветы для проращивания и термотерапии.
4. Проростки, прошедшие термотерапию, поместить в 6 % раствор хлорамина на 5 минут, промыть стерильной дистиллированной водой.
5. В ламинар-боксе под микроскопом вычленить апикальные меристемы и поместить их в пробирки с питательными средами.
6. Весь растительный материал перенести в культуральную комнату.
7. Результаты зарисовать через 2-4-6-8 недель.
Работа 7. ПОЛУЧЕНИЕ ВЕЗВИРУСНОГ0 ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА МЕТОДОМ ХИМИОТЕРАПИИ В СОЧЕТАНИИ С МЕТОДОМ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ.
Объяснение. Для химиотерапии используют специальные вещества-ингибиторы вирусов: ферменты, влияющие на нуклеиновые кислоты (РНК-азы). Непосредственную обработку клубней ферментом можно проводить методом инфильтрации в вакуумной камере в течение 20 минут, что приводит к большому расходу вещества. Поэтому эффективнее добавлять РНК-азы в питательные среды для культивирования апексов.
РНК-аза стимулирует рост и развитие растений из апексов и ингибирует развитие вирусов. В результате применения такой технологии выращивания на 10–35 % повышается приживаемость меристем на питательных средах, на 30–40 % больше образуется растений-регенерантов.
Материалы и оборудование. Пробирки с питательными средами, ламинар-бокс, фильтры Зейтца, стерильная бидистиллированная вода, флаконы с 96 % спиртом, спиртовки, микроскопы МБС-9 или МБС-10, стерильные инструменты (скальпели, препарировальные иглы, пинцеты), раствор РНК-азы (0,01 н), химическая посуда (колбы на 50-100 мл, стаканы на 50-100 мл, мерные цилиндры), проростки картофеля.
Ход работы.