Для количественного определения жизнеспособности суспензии используют вещества, участвующие в метаболизме клетки: флуоресцеиндиацетат расщепляется в клетке эстеразами с образованием флуоресцеина, дающего флуоресценцию цитоплазмы живых клеток. Активность эстеразы определяют на спектрофотометре. Окрашивание клетки солями тетразоля позволяет определить интенсивность дыхания клетки.
Материалы и оборудование. Микроскоп, флакон с 0,1 % раствором метиленового синего, предметные и покровные стекла, фильтровальная бумага, дистиллированная вода, марлевые салфетки, пипетки.
Ход работы.
1. Приготовить препарат суспензии: встряхнуть суспензию в колбе, пипеткой отобрать небольшое количество суспензии, поместить каплю суспензии на предметное стекло, добавить каплю красителя, накрыть покровным стеклом, излишки жидкости убрать фильтровальной бумагой.
2. Поместить препарат на столик микроскопа под малое увеличение объектива и подсчитать клетки и агрегаты в 3-х полях зрения (просмотреть не менее трех препаратов).
3. Результаты записать в таблицу.
4. Один препарат зарисовать, описать морфологию клеток суспензии (форму, величину).
5. Сделать вывод о степени агрегированности суспензий (какие фракции преобладают, %) и жизнеспособности суспензии (неокрашенных клеток, %).
Работа 4. ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ КЛОНОВ НА АГАРИЗОВАННЫХ СРЕДАХ. МЕТОД ПЛЕЙТИНГА.
Объяснение. Культивирование отдельных (одиночных) клеток позволяет получать клоны и исследовать генетическую и физиологическую стабильность или изменчивость клонового материала. Одиночные клетки или изолированные протопласты используются в клоновой селекции мутантных, гибридных и трансформированных линий. В эти клетки можно ввести новые гены, в то же время — это хорошая модель для изучения онтогенеза и физиологии клетки.
Источником отдельных (одиночных) клеток являются клеточные суспензии, растущие на жидкой питательной среде; мацерированные ткани растений (мезофилл листа); изолированные протопласты после восстановления клеточной стенки.
Наиболее эффективными методами для получения одиночных клеток являются: метод «кормящего слоя» или «культуры-няньки», кондиционированных сред, микрокапель. Для получения генетически стабильных клонов и клеточной селекции используется метод плейтинга.
Материалы и оборудование. Колбы с суспензией, стерильные чашки Петри, стерильный цилиндр, чашки Петри с агаризованной средой, инструменты: пинцеты, препарировальные иглы, спиртовка, 96 % спирт.
Ход работы.
1. Пипеткой отобрать 5 мл верхней фракции суспензии (в верхнем слое суспензии преобладает фракция одиночных клеток) и смешать с 5 мл агаризированной (1,4 % агара) среды для культивирования каллуса. Работу проводить в стерильной посуде: мерном цилиндре, стакане.
2. Полученную смесь разлить в стерильные чашки Петри слоем до 1 см.
3. Чашки Петри закрыть крышками и герметизировать парафином.
4. Количество колоний подсчитать через 4–6 недель.
5. Результаты зарисовать, подсчитать плотность высева по формуле:
Эффективность высева = количество образовавшихся колоний х 100 % / количество высеянных клеток
Работа 1. ИНДУКЦИЯ ОРГАНОГЕНЕЗА И СОМАТИЧЕСКОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА В КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ ТАБАКА ПОД ДЕЙСТВИЕМ ФИТОГОРМОНОВ.
Объяснение. Фитогормоны — это биологические регуляторы роста и развития растений, осуществляющие взаимодействие клеток, тканей и органов, стимулирующие и ингибирующие морфогенетические и физиологические процессы в растительных организмах. Фитогормоны влияют на деление и рост клеток растяжением, состояние покоя, созревание, старение, формирование пола, устойчивость к стрессу, тропизмы, транспирацию; обеспечивают функциональную целостность растительного организма, закономерную последовательность фаз индивидуального развития.
По химической природе гормоны растений четко подразделяются на две группы: производные мевалоновой кислоты (гиббереллины, абсцизины, брассины, фузикокцин, цитокинины), производные аминокислот (ауксины — из триптофана, этилен — из метионина и аланина). Биосинтез фитогормонов происходит в определенных частях растений: в апексах побегов образуется ИУК-индолил-3-уксусная кислота, лист служит донором ключевого продукта синтеза гиббереллинов — каурена, а также абсцизовой кислоты, в апексах корней синтезируется кинетин, а в зоне растяжения корня — гиббереллины, источником зеатина является эндосперм проростающих семян.
По функциональному действию различают 5 основных групп фитогормонов: ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизины и этилен. Ауксины в культуре тканей вызывают рост клеток растяжением, в больших концентрациях — деление клеток, в сочетании с цитокининами — органогенез. В биотехнологии применяют как природные ауксины (ИУК), так и синтетические [ИМК (индолил-3-масляная кислота), ИПК (индолил-3-пропионовая кислота), 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота), НУК(нафтилуксусная кислота)].
Цитокинины в сочетании с ауксинами индуцируют митозы, пролиферацию клеток, почек и побегов. К природным цитокининам относятся: зеатин, кинетин (6-фурфуриламинопурин), NN-дифенилмочевина (кокосовое молоко); к синтетическим — 6-ЕАП (6-бензиламинопурин).
Гиббереллины стимулируют рост клеток растяжением, а также синтез ауксинов и цитокининов. Сейчас известно около 60 видов гиббереллинов. В культуре ткани используется гибберелловая кислота.
Абсцизины (АБК — абсцизовая кислота) и этилен ингибируют ростовые процессы, деление клеток, в сочетании с цитокининами и хлорхолинхлоридом индуцируют органогенез (образование микроклубней).
Гормональная система тесно связана с генетическим аппаратом клетки. Фитогормоны не только влияют на степень метилирования ДНК и таким образом регулируют экспрессию генов, но и связываются с белками — репрессорами на опероне, что приводит к активации структурных генов и синтезу определенных ферментов.
Следовательно, изменяя соотношение гормонов в питательных средах, можно в какой-то степени изменять и генетические программы клеток и тканей. Эти процессы известны как дедифференциация, редифференциация и дифференциация клеток и тканей.
Материалы и оборудование. Пробирки с каллусами табака, колбы на 50 мл со стерильном питательной средой (МС без гормонов), колбы со средами для стеблевого органогенеза и соматического эмбриогенеза и индукции ризогенеза, флаконы с 96 % спиртом, стерильные пинцеты и препарировальные иглы, спиртовка, ламинар-бокс.
Ход работы.
1. Стерильным пинцетом переложить каллусы на стерильную поверхность стола ламинар-бокса, разделить на кусочки 5x5 мм. и поместить в колбы с питательными средами, содержащими различные наборы фитогормонов.
2. Колбы перенести в культуральную комнату с температурой 25 + 2 °C, влажностью воздуха 70 % и интенсивностью освещения 5kLx.
4. Результаты эксперимента зарисовать через 2-4-6-8 недель.
Работа 2. ИНДУКЦИЯ ДЕЛЕНИЯ КЛЕТОК И РОСТА КЛЕТОК РАСТЯЖЕНИЕМ ПОД ДЕЙСТВИЕМ АУКСИНА И ГИББЕРЕЛЛИНА.
Объяснение. В растении фитогормоны находятся в тесном взаимодействии друг с другом: ИУК индуцирует синтез этилена и цитокининов, ГК увеличивает содержание ИУК, цитокинины усиливают синтез МУК, но снижают содержание свободной АБК, этилен тормозит транспорт ИУК и увеличивает содержание АБК.
В культуре ткани фитогормоны, добавленные в различных пропорциях, регулируют синтез эндогенных гормонов растений, что проявляется в разнообразных морфогенетических реакциях клеток и тканей.
В 1955 г. Скуг и Миллер предложили гипотезу гормональной регуляции в культуре клеток и тканей, которая сейчас известна, как правило Скуга-Миллера: если концентрация ауксинов и цитокининов в питательной среде относительно равны или концентрация ауксинов незначительно превосходит концентрацию цитокининов, то образуется каллус; если концентрация ауксинов значительно превосходит концентрацию цитокининов, то формируются корни; если концентрация ауксинов значительно меньше концентрации цитокининов, то образуются почки, побеги.