При всех известных методах консервирования неизбежно происходит потеря определенного количества ядросодержащих, в том числе живых, клеток.
Поиск дальнейших путей повышения эффективности методов консервации при положительных температурах предопределил интерес к изучению возможностей индуцирования наилучших для консервации условий взаимодействия клеток со средой, повышения резистентности и пр.
Литературные данные свидетельствуют, что решению этих вопросов в значительной мере может способствовать использование для консервации биологически активных веществ и ряда физических факторов. Клетки периферической крови, отличавшиеся друг от друга не только по морфологическим особенностям, но и по типу обмена, в условиях консервирования обладают различной устойчивостью к физико-химическим воздействиям окружающей среды.
Особое значение приобретает исследование мембран клеток при их консервировании. Именно плазматическая мембрана клетки играет роль биологического барьера, обусловливающего проницаемость для различных веществ и воды. Мембрана ответственна за проникновение в клетку субстратов питания из плазмы и консервирующих растворов и за выделение из клеток продуктов распада, образующихся в процессе обмена веществ. Для этого на клетки воздействуют поверхностно-активными веществами, мембранотропными агентами, взаимодействующими с липидами мембран, антиоксидантами и др.
Серия исследований, проведенных в нашей лаборатории по изучению биологического действия ЭМ на клетки, убедила нас, что разработка консервантов клеток на основе ЭМ перспективна. Такие свойства некоторых ЭМ, как высокая бактерицидная антиоксидантная активность, способность стабилизировать клеточные мембраны, повышать митотическую активность клеток, влиять на репарацию ДНК, на ферментные и обменные процессы клеток, К—Na-ионные каналы, позволили предположить возможность использования ЭМ в качестве консервантов клеток.
Первые серии экспериментов показали с достаточной степенью достоверности (0,05>Р>0,0001), что ЭМ шалфея, кориандра, базилика, непеты, полыни, эвкалипта, бархатцев в количестве 2,5∙10-5 мг/мл могут повышать число жизнеспособных клеток в культуре на 10— 20% по отношению к контролю. В дальнейшем было выявлено, что аналогичным действием обладают большинство из исследованных масел. Разведение 2,5∙105 —2,5∙10-8 мг/мл способствовало увеличению числа жизнеспособных клеток. Более низкие концентрации эфирных масел не оказывали влияния на клетки, более высокие (2,5∙10-1) подавляли рост культур (табл. 22).
Функциональная активность лимфоцитов снижалась и в контрольной, и в опытных группах по мере увеличения срока культивирования. Тем не менее отмечена статистически достоверная разница увеличения количества бластных форм клеток на 7-е сутки культивирования при консервировании их с помощью ЭМ. Следовательно, добавление в среду небольших концентраций ЭМ способствует не только выживаемости клеток, но и сохранению их функциональной активности.
Таблица 22. Жизнеспособность лимфоцитов в культуре с добавлением ЭМ
Контроль
ЭМ полыни
ЭМ шалфея
ЭМ эвкалипта
1
2
3
1
2
3
1
2
3
47,41 Р
57,09
0,1
65,55
0,001
60,05
0,001
63,34
=0,05
68,05
0,001
67,6
0,001
51,1
0,05
51,2
0,1
57,05
=0,05
Примечания.
1. Конечная концентрация указанного вещества — 2,5·10-6 мг/мл среды.
2. Конечная концентрация указанного вещества — 2,5·10-7 мг/мл среды.
3. Конечная концентрация указанного вещества — 2,5·10-8 мг/мл среды.
Композиции интерферон + базилик и интерферон + базилик + витамин Е (также с высокой степенью достоверности) повышали количество жизнеспособных клеток в культуре на 10-е сутки культивирования относительно контроля — 0,05<Р<0,001. В отдельных случаях количество жизнеспособных клеток в 2 раза превышало аналогичный показатель в контроле (табл. 23).
Таблица 23. Влияние ЭМ базилика, интерферона, витамина Е и их смесей на выживаемость лимфоцитов
Контроль
Базилик
Интерферон
Витамин Е
Базилик + интерферон + витамин Е
22,95
33,9
Р<0,001
26,2
Р<0,1
32,3
Р<0,001
45,3
Р<0,001
Далее, изучив более 10 различных ЭМ, мы обратили внимание на ЭМ монарды, которое обладало высоким консервирующим действием. Оно было взято для дальнейших исследований по разработке консервирующего средства.
Изучение предлагаемого консервирующего средства проводили следующим образом.
К 250 мл донорской крови, содержащей стандартный консервант 7б в соотношении 1:4, добавляют 0,25% эмульсию ЭМ монарды в количестве 1—2 мл и перемешивают, 2—3 раза переворачивая флакон. Кровь хранят в холодильнике при 4 °С в течение 2 нед. В аналогичных условиях хранят кровь, содержащую стандартный консервант 76, но без ЭМ монарды (контрольные опыты).
По истечении указанного срока исследуют устойчивость эритроцитов к кислотному гемолизу по методике Стори и Педерцини: консервированную кровь смешивают с равным объемом соляной кислоты. Интенсивность гемолиза эритроцитов учитывают по шкале нефелометра через каждые 30 с при постоянном перемешивании и температуре 24 ˚С.
Результаты проведенных исследований показали, что присутствие в консервированной крови 0,25% водной эмульсии ЭМ монарды способствует уменьшению интенсивности гемолиза наименее стойких эритроцитов и, не повышая гемолиза основной массы эритроцитов, приводит к увеличению времени окончательного гемолиза эритроцитов по сравнению с контрольной группой.
Так, наивысшая интенсивность гемолиза в контрольной пробе наблюдалась на протяжении 3—4 мин. В среднем за 30 с количество эритроцитов в контроле снижалось на 1,06 тыс. клеток в 1 мм.куб. против 0,55 тыс. клеток в 1 мм.куб. в пробе с ЭМ монарды.
В контрольной пробе крови к концу 6-й минуты все эритроциты были гемолизированы, а эритроциты, обработанные ЭМ монарды, лизировались к этому времени лишь на 54,4%; гемолиз эритроцитов с предлагаемым средством заканчивался к 10-й минуте, что в 2 раза превышало аналогичный показатель в контроле.
Сводные данные получены при добавлении 0,25% водной эмульсии ЭМ монарды в кровь, которая перед этим хранилась в течение 2 нед при 4 °С без ЭМ монарды.
Добавление ЭМ монарды способствует уменьшению гемолиза эритроцитов донорской крови при ее хранении в 2 раза.
Для изучения качества консервируемых препаратов крови было проведено сравнение формулы крови до и после хранения в стандартном 7б и предлагаемом консервантах с добавлением эмульсии ЭМ монарды.
В препарате крови, содержащейся в стандартном консерванте, значительно уменьшилось количество сегментоядерных лейкоцитов и увеличилось относительное количество лимфоцитов и моноцитов. Изменений же в формуле крови препаратов, консервированных в растворе 7б с добавлением эмульсии ЭМ монарды, практически не наблюдалось. Таким образом, предлагаемый консервант способствует сохранению исходного клеточного состава консервируемой крови.
Применение ЭМ монарды позволяет расширить ассортимент средств для консервирования крови, сыворотки (плазмы) и эритроцитов, увеличить срок хранения донорской крови в 2 раза, значительно снизить существующие в настоящее время нормы забора крови и связанные с этим финансовые затраты.