Одной из наиболее массовых модификаций И-16 был тип 5. Запущенный в серию в 1935 г., он являлся развитием опытного И-16 с РЦФ-3. Его вооружение состояло из двух пулеметов ШКАС в центроплане, а максимальная скорость достигала 454 км/ч. Кабина летчика полностью закрывалась легко сдвигаемым вперед фонарем. Однако, несмотря на надежность конструкции, пилоты продолжали летать с открытыми фонарями.
В 1936 г. построена пушечная модификация- типа 5 -тип 12. В его крыле, кроме пулеметов, установили две пушки ШВАК калибра 20 мм. Параллельно на базе И-16 с мотором М-22 создали учебно-тренировочный самолет УТИ-2. В том же году КБ Поликарпова было переведено на завод № 84 в Химках. В дальнейшем подобные переезды повторялись неоднократно и стали для Николая Николаевича серьезнейшей проблемой.
В 1937 г. появился И-16 тип 6. Учитывая пожелания летчиков, конструкторы выполнили кабину открытой с козырьком, сохранившимся на всех последующих модификациях. Тип 6 оснастили двигателем М-25А (730 л.с.), летные данные и вооружение соответствовали типу 5.
В этом же году был построен И-16 тип 10 с двигателем М-25В (750 л.с.). Самолет имел усиленную конструкцию и посадочные щитки, впервые примененные на серийных истребителях СССР. В дополнение к двум крыльевым пулеметам над мотором появились еще два синхронных ШКАСа. Взлетный вес возрос на 200 кг. Скорость снизилась до 438 км/ч. Для этой модификации впервые в мировой практике были спроектированы убирающиеся лыжи. Тип 10 послужил основой для разработки учебно-тренировочного истребителя УТИ-4 (И-16 тип 15).
Одновременно шли работы по установке на И-16 двигателей М-62 и М-63, представлявших собой более мощные варианты М-25 с двухскоростными нагнетателями.
В начале 1938 г. КБ Поликарпова переводят на завод №156, где ранее работал арестованный в ноябре 1937 г. А.Н. Туполев. К этому времени относится создание пушечной модификации типа 10 - тип 17, на котором заменили крыльевые пулеметы на две пушки ШВАК. Дополнительно предусматривалась подвеска до 200 кг бомб. Взлетный вес возрос до 1810 кг. Скорость снизилась до 425 км/ч, ухудшилась маневренность. Самолет предполагалось использовать против бомбардировщиков.
Летом в Горьком начались испытания И-16 тип 18 с мотором М-62 (830/900 л.с.) и винтом изменяемого шага (первоначально ВИШ-6А, затем АВ-1). Вооружение соответствовало типу 10. Благодаря более тяжелому двигателю улучшилась продольная устойчивость (центровка 27.2% САХ). Скорость возросла до 461 км/ч, улучшилась скороподъемность.
И-16 тип 29 на испытаниях в НИИ ВВС. Под крыльями - подвесные баки и направляющие для РС-82
В том же году появился И-16 тип 24. Самолет имел мотор М-63 взлетной мощностью 11C? л.с. (номинальная - 930 л.с.). На нем усилили конструкцию крыла, предусмотрели установку радиостанции РСИ-3, фотокинопулемета, подвесных баков. Максимальная скорость на высоте 4800 м достигла 489км/ч. Нормальный взлетный вес составил 1780 кг, максимальный-2052 кг. Типы 18 и 24 имели пушечные модификации, которые получили обозначения тип 27 и 28 (аналогично типам 10 и 17).
В 1940 г. выпущена последняя серийная модификация И-16 тип 29 с мотором М-63 и винтом АВ-1. В отличие от типа 24 его маслорадиатор установили снизу капота с правой стороны между 4 и 5 цилиндрами. Шасси укоротили на 32 мм, что позволило разместить под двигателем пулемет БС (12,7 мм) в дополнение к синхронным ШКАСам. Вооружение в крыле было снято. Под плоскостями так же, как и на некоторых сериях типа 24, предусматривалась установка шести реактивных снарядов РС-82. Расчетная скорость на высоте 4500 м равнялась 510 км/ч, но фактически она была близка к типу 24. Нормальный взлетный вес составлял 1900кг, максимальный - 2140 кг.
Первое боевое крещение И-16 получил в 1936 г. в небе Испании. Всего туда было отправлено 455 истребителей типов 5 и 10, УТИ-4. Кроме того, на республиканских заводах до 1 января 1939 г. выпустили 7 И-16 и 2 УТИ-4.
В воздушных боях И-16 имел полное превосходство над истребителями путчистов "Хейнкель-51" и "ФиатСР-32". Один из летчиков легиона "Кондор" вспоминал: "Мы вдруг поняли всю серьезность положения. Наши старые "Хейнкели-51" были слишком медлительны по сравнению с этими новыми "крысами"." Это казалось невероятным, но они поднимались выше нас и могли играть с нами, как им захочется".
В феврале 1937 г. в Испании появились первые серийные "Мессершмитты" ВF-109В-1, а несколько позднее -ВF-109В-2 и Bf-109C. Схватки с ними показали, что при почти равном вооружении эти самолеты не превосходят И-16 в скорости, уступают ему в скороподъемности, но имеют преимущество на виражах. Bf-109 выполняли установившийся вираж при отклоненных закрылках на скорости 170-180 км/ч, а И-16 -на 220 -240 км/ч, и радиус виража у него получался больше. В целом по сумме боевых качеств эти машины были близки. Но весной 1938 г. началось производство Bf-109D-1, а в начале 1939 г. - ВF-109Е-1, оснащенных значительно более мощными двигателями и вооруженных, кроме пулеметов, одной - двумя 20 мм пушками. Скорость этих машин доходила до 540 км/ч, и бороться с ними на И-16 стало очень трудно.