В соответствии с новым назначением самолета большое внимание было уделено увеличению продолжительности и дальности полета. Крыло базового Пе-2 содержало 8 бензобаков, существенно увеличить объем которых не представлялось возможным без серьезных переделок конструкции, для чего просто не было времени. Поэтому дополнительные баки на 700 л горючего, необходимые для получения требуемой дальности полета 2000 км, были размещены в фюзеляже недалеко от центра тяжести: один из баков установили в бомбоотсеке, а два других - на месте кабины стрелка. Так самолет стал двухместным. Впрочем, нижний люк в хвостовой части фюзеляжа оставили, и при перебазировании техники самолетов улетали со своими машинами.
На истребителе несколько усилили наступательное вооружение, разместив в носовой части фюзеляжа дополнительный 12,7-мм пулемет БК с боезапасом 150 патронов. Таким образом, носовая стрелковая установка опытного Пе-3 состояла из двух пулеметов БК и одного ШКАСа с 750 патронами. На серийных Пе-3 ШКАС сняли, но зато увеличили боезапас у БК до 250 патронов на ствол. Конструкторы прекрасно сознавали недостаточность такого вооружения, но из-за дефицита времени наращивание огневой мощи нового истребителя решили произвести позднее, в ходе доработок. Верхнюю турельную установку штурмана с пулеметом ШКАС взяли без изменений от Пе-2. Поскольку вести огонь назад-вниз теперь было некому, вспомнили об отработанной еще для высотного истребителя «100» хвостовой неподвижной установке пулемета ШКАС с боекомплектом 250 патронов, которую и установили на Пе-3.
Бомбардировочное вооружение радикально упростили. От обычного Пе-2 остались лишь четыре бомбодержателя: два в бомболюках мотогондол и два наружных под фюзеляжем. Суммарная масса бомбовой нагрузки уменьшилась: нормальная - до 400 кг, а перегрузочная - до 700 кг (две бомбы по 250 кг и две по 100 кг). Электрическую систему управления сбрасыванием бомб демонтировали, оставив только аварийную механическую. Тормозные решетки под консолями вместе с приводами были ликвидированы, что в дальнейшем оказалось неоправданным, т.к. Пе-3 пришлось часто применять в качестве бомбардировщика.
Вместо радиостанции РСБ-бис в кабине штурмана установили РСИ-4. Это нововведение также вряд ли можно признать удачным. При боевом радиусе 700-800 км дальность связи с землей составляла всего 110 км, а с другими самолетами и того меньше - 50-60 км. Положение еще более ухудшилось после снятия с истребительного варианта «пешки» радиополукомпаса, что было сделано с целью облегчения самолета.
Опытный Пе-3, переделанный из уже построенного серийного Пе-2 (зав. номер 391606, что означало - шестой самолет шестнадцатой серии завода №39), весил при нормальной загрузке 7860 кг. Масса пустого составляла 5890 кг. При испытаниях его в НИИ ВВС получили следующие основные летно-технические характеристики: максимальную скорость на высоте 5000 м - 530 км/ч, потолок - 9000 м и максимальную дальность полета - 2150 км. Эти данные признали удовлетворительными, и уже 14 августа на завод №39 поступило распоряжение развернуть серийное производство Пе-3. Сроки вновь установили очень жесткие: к 25 августа завод должен был собрать 5 самолетов по образцу опытного и перейти на их выпуск.
Головной серийный Пе-3 проходил испытания в НИИ ВВС с 29 августа по 7 сентября 1941 г. Заводские номера самолетов продолжали нумерацию Пе-2, и первый серийный истребитель имел номер 391902. Испытательные полеты, производившиеся на Центральном аэродроме в Москве, выявили примерно такие же летные характеристики, как и у опытного самолета. Максимальная скорость серийной машины, полученная на испытаниях, составила 535 км/ч. Интересно сравнить летно-технические данные Пе-3 с характеристиками близкого по размерности и назначению немецкого истребителя «Мессершмитт» Bf 110С. При практически одинаковой дальности, скорости полетау земли (445 км/ч) и времени набора высоты 5000 м (8,5-9 мин) «мессер» был на 1350 кг легче и обладал лучшей маневренностью в горизонтальной плоскости. Носовая батарея из четырех пулеметов MG17 и двух пушек MG/FF обеспечивала массу секундного залпа, заметно превышавшую этот показатель Пе-3. Вместе с тем, на границе высотности мотора советский истребитель был несколько быстроходнее своего германского оппонента.
Серийное производство Пе-3 разворачивалось с большими трудностями. Комплекты чертежей на ряд узлов подготовить не успели, поэтому первые машины собирали по эскизам, а детали подгоняли по месту. Новые крупные сборочные единицы - бензобаки, носовая установка дополнительного пулемета БК и хвостовая установка ШКАСа не были в достаточной степени отработаны, что приводило к сбоям производства.
В процессе «отстрела» носовой установки выяснилось, что плексигласовый носок фюзеляжа не выдерживает давления дульных газов и разрушается. Его заменили сначала на дюралевый, а позднее на стальной. Заметим, что отличия, связанные с ликвидацией части остекления в носу фюзеляжа, являются важнейшими признаками, позволяющими опознать Пе-3 среди бомбардировщиков Пе-2, ведь внешне самолеты почти не отличались друг от друга. Кроме упомянутых, характерными признаками Пе-3 являются: отсутствие тормозных решеток (их не было и на разведчиках Пе-2), бортовых блистеров, верхнего остекленного люка и стрелковой установки радиста в средней части самолета. Хвостовой ШКАС был практически незаметен.
Новые стрелковые установки имели ряд дефектов. Гильзы и звенья крупнокалиберных пулеметов, вылетавшие при ведении огня наружу, били по передней кромке крыла, нижней поверхности фюзеляжа, образуя царапины, вмятины и рваные отверстия в обшивке. В отдельных случаях гильзы залетали даже в тоннели водорадиаторов. Эксперименты с изменением формы гильзо- и звеньеотводов практически ничего не дали. В конце концов решили просто собирать гильзы и звенья в специальные гильзо-сборники. По оценке ведущего инженера Макарова и летчика Степанчонка, серийный Пе-3 нуждался в доработках, важнейшими из которых должны были стать: усиление наступательного вооружения за счет установки пушки ШВАК в дополнение к двум пулеметам БК; усиление оборонительного вооружения путем замены турельного ШКАСа штурмана на крупнокалиберный пулемет БТ; введение бронирования экипажа спереди и увеличение размеров задней бронеплиты штурмана; замена радиостанции РСИ-4 на другую, с большим радиусом действия; установка на часть машин фотоаппаратов для использования Пе-3 в качестве разведчика.
Однако все эти изменения невозможно было внедрить в серию немедленно, поэтому самолеты пошли в строевые части в комплектации, соответствующей головному серийному Пе-3. Всего в 1941 г. построили 196 Пе-3 (16 - в августе, 98 - в сентябре и 82 - в октябре). Кроме того, завод изготовил опытную машину Пе-Збис (первого варианта). В ноябре завод эвакуировался в Иркутск, поэтому вплоть до апреля 1942 г. выпуск истребителей прекратился.
Изучение возможностей Пе-3 для применения в качестве ночного истребителя производилось силами Научно-испытательного полигона авиационного вооружения (НИП АВ) ВВС в начале сентября 1941 г. Летчик-испытатель Степанчонок и штурман воентехник первого ранга Нос выполнили отстрел всех огневых точек машины и убедились, что пламя выстрелов сильно слепит экипаж. Сетка прицела К8-Тстановилась невидимой, и огонь приходилось вести, наводя по трассе. Специалисты по вооружению отреагировали на замечания оперативно и установили на стволы пулеметов пламегасители. Повторные испытания показали, что вспышки выстрелов мешать перестали.
В ходе испытаний выявилась необходимость в ночных шторках на нижнее остекление кабины, без которых случайное попадание самолета в луч прожектора воспринималось как физический удар по глазам, которые немедленно заливало слезами, и летчик терял ориентацию. Шторки были быстро разработаны и установлены. Затем на Пе-3 опробовали (впервые в СССР) ультрафиолетовое освещение в кабине экипажа и фосфоресцирующие составы на шкалах приборов. Все нововведения были рекомендованы к внедрению в серийное производство.