Структура Малоросійської колегії багато в чому повторювала схожі на неї колегіальні органи, які на той час існували в Російській імперії. Колегія складалася з президента, котрий мав перебувати у чині генерала, а також із шести членів, на посади яких призначали штаб — офіцерів зі складу місцевих гарнізонів російських військ. Ці члени колегії повинні були змінюватись на посадах раз на кілька років. Крім них, до складу установи, що керувала Україною, входив прокурор, якого обирали з капітанів або капітанів — поручиків гвардії. Цар мав намір щороку змінювати чиновників на цій посаді. До складу колегії входили також канцелярія і шість галузевих контор, кожну з яких інспектував один з членів колегії. Канцелярія на чолі з секретарем складалася з нотаріуса, актуарія, реєстратора, перекладача і більше десятка канцеляристів, підканцеляристів і копіювальників. Галузевими конторами були ті ж канцелярії, але з меншим штатом. Кріпосна контора, яка раніше завідувала збиранням мита з судових справ і складанням кріпосних актів на нерухоме майно, указом Петра І від 3 червня 1726 року була ліквідована.
В цивільному відношенні Малоросійська колегія була підпорядкована російському Сенату, а саме сенатській конторі малоросійських справ. Військова ж влада над Україною відтепер зосереджувалася в руках головнокомандувача російських військ в Україні (головного малоросійського командира). Самій же Малоросійській колегії були підпорядковані всі органи українського самоврядування, тобто козацький гетьман — до скасування цієї посади в 1722 році, Генеральний військовий суд, Генеральна військова канцелярія та інші. Крім того, Малоросійська колегія мала призначати очільників підрозділів війська, що розташовувались як гарнізони в українських містах.
Згідно з інструкцією, виданою у Санкт — Петербурзі 16 травня 1722 року, Малоросійська колегія мала приймати від населення чолобитні на Генеральну військову і полкові канцелярії, на Генеральний та полкові суди Запорозького Війська, а також на суди ратушні. Відтепер лише Малоросійська колегія виносила ухвали за скаргами на відповідні установи. Вона розпоряджалася грошовими і хлібними зборами з населення і розподілом повинностей в Україні. Окремим пунктом в інструкції для Малоросійської колегії стояло завдання спостерігати за тим, щоб козацька старшина не гнобила народ податками, роздавала платню сердюкам і компанійцям, щоб російські солдати при постої місцевим жителям «обид не делали и лишнего с них не требовали». Втім, цей пункт потрапив до інструкцій новоствореного органу управління Україною не через занепокоєння царської влади життям пересічних українців, а радше через її прагнення замилити очі простому люду. Що ж до реальних дій російської влади в Україні під час роботи Малоросійської колегії, то вони продемонстрували справжнє «братерське» піклування Російської імперії про Україну. Це піклування виявилося лише в збільшенні податків, подальшому закріпаченні селянства, у втраті козацькою старшиною можливості вплинути на політику Гетьманщини, а також у багатьох нещастях, на які імперська влада прирекла Україну.
До переліку обов'язків Малоросійської колегії входили також судочинство і розгляд справ за скаргами українців на російських військовослужбовців, а також розгляд скарг останніх на українців. Крім того, колегія мала подавати російському Сенату проекти нових указів, що мали стосунок до українських справ. Сенатським указом від 3 червня 1724 року Малоросійській колеги було підпорядковано й українське православне духовенство. Всі розпорядження гетьмана (поки був живий Іван Скоропадський) і генеральної козацької старшини вважалися недійсними без затвердження чиновниками Малоросійської колегії. Надання колегії таких повноважень демонструвало козацтву, хто є справжнім господарем їхньої країни і реальним командувачем Запорозького Війська. Тож не буде перебільшенням стверджувати, що Малоросійській колегії належала вся повнота влади в Україні. Вона самостійно вирішувала найважливіші політичні, адміністративні та фінансові питання, часто — густо йдучи при цьому всупереч інтересам козацької старшини, що викликало невдоволення козацтва і зростання тих самостійницьких настроїв, які Московське царство щосили придушувало від 1654 року.
Малоросійська колегія почала функціонувати в Україні в досить сприятливий для російської сторони час. Перемоги, отримані Петром І у Північній війні, створювали непогані умови для придушення козацьких виступів і зосередження влади в руках колегії. Щоправда, імператорський уряд був занепокоєний можливою активізацією «сепаратистської» діяльності автономістів — самостійників усередині країни та козаків на чолі з гетьманом Пилипом Орликом за її межами.