Таблица 4.3. Соотношение различных типов коллагена из кожи крыс как функция возраста
Изучены изменения поперечных сшивок коллагена из бычьей кожи по мере развития животных [67]. В коже зародышей много сшивок типа ДДОЛНЛ, которые делают ее плохо растворимой. К рождению доля этих сшивок уменьшается примерно на одну треть. В возрасте 6 мес их практически нет, их заменяют диоксилизинонорлейцин (ДОЛНЛ) и фракция С. До 18 мес количество этих сшивок постепенно увеличивается и составляет около 95 % всех сшивок. В коже человека максимальное количество ДОЛНЛ и фракции С наблюдается в возрасте 17–20 лет.
В период развития коллаген постоянно обновляется. По-видимому, изменение характера поперечных сшивок и их соотношения в течение этого периода обусловлено появлением α-цепей различных типов. Обмен коллагена постепенно замедляется, так как развитие сопровождается уменьшением скорости синтеза и разрушением коллагена. Показано, что потребление в коже крыс аскорбиновой кислоты, которая является кофактором и пролил- и лизилгидроксилазы, велико при рождении и быстро уменьшается по мере развития животных. В возрасте 6 мес потребление аскорбиновой кислоты составляет одну сотую от ее потребления при рождении. Вместе с тем аскорбиновая кислота в течение всей жизни поглощается костями и связками, правда после 12 нед ее поглощение падает. Очевидно, синтез коллагена в коже крыс в возрасте 6–8 нед практически прекращается, тогда как в костях и связках он продолжается всю жизнь. Следовательно, аскорбиновая кислота требуется млекопитающим в течение всей жизни для поддержания нормального состояния костей и связок. Описанные результаты позволяют предположить, что появление в старческом возрасте морщин на коже может быть связано не только с прекращением обмена коллагена в ткани, но также с увеличением числа поперечных сшивок между мономерами коллагена, отложившегося в коже на ранних стадиях развития. Сообщают, что число сшивок в коллагене сухожилия хвоста крысы увеличивается в возрастном интервале 3-100 нед от 1 на 500000 до 1 на 50000, т. е. в 10 раз [93]. Это может изменить не только физические свойства коллагена, но и его способность экстрагироваться солевым раствором [32].
Другим фактором, влияющим на обмен коллагена в течение жизни животного, является фермент коллагеназа. Этот фермент расщепляет в коллагене связь Gly — Leu [31]. Паратгормон стимулирует синтез коллагеназы и вызывает деминерализацию костей. В матке в период беременности синтез фермента усиливается, тогда как прогестерон ингибирует его синтез [30]. В коже человеческого эмбриона коллагеназы больше, чем у взрослого человека. Если кожу эмбриона и взрослого человека культивировать in vitro, то из первой выделяется в среду значительное количество латентной, неактивной, коллагеназы (зимогена), однако из последней латентная коллагеназа не выделяется [72]. Молекулярная масса латентной коллагеназы из кожи человека — 55000-60000, а активной коллагеназы — 45000-50000 [75]. Если латентный фермент пропустить через колонку с сефадексом G-50, обработанным предварительно NaI, то он активируется. Трипсин удаляет из молекулы фермента пептид с мол. массой 10000 и активирует его. Таким образом, фермент, по-видимому, инактивируется путем связывания с ингибитором, имеющим мол. массу 10000. Комплекс фермент — ингибитор (латентная коллагеназа) активируется тиолблокирующими агентами, например 4-аминофенилмеркуриацетатом [70]. Природу ингибитора еще предстоит установить, однако ясно, что активность коллагеназы может быть еще одним контрольным пунктом обмена коллагена и изменения его структуры при старении.
Согласно одной из теорий старения, основанной на образовании поперечных сшивок [90], увеличение числа таких сшивок в коллагене и других внеклеточных макромолекулах вызывает изменение физических и химических свойств соединительных тканей. Свидетельством в пользу этой теории служит то, что экстрагируемость коллагена из кожи и его расщепление коллагеназой с возрастом уменьшаются, а его термостабильность и сила сокращения при этом увеличиваются. Даже если увеличение числа сшивок и вызывает эти изменения и оказывает влияние на функционирование соединительных тканей при старении животного, старение других тканей, не имеющих большого количества внеклеточного матрикса и коллагена, должно иметь другие причины. Кроме того, образование поперечных сшивок происходит после модификации, осуществляемой с помощью лизилоксидазы. Изменение содержания этого фермента в соединительных тканях с возрастом также может быть причиной увеличения числа сшивок.
В ряде работ [5, 9] сообщается, что количество поперечных сшивок в коллагене при старении растет. Однако более поздние исследования не подтверждают это заключение. Когда измеряли число сшивок в сухожилии коров 3- и 12-летнего возраста после расщепления коллагена цианогенбромидом, никакой разницы в количестве ковалентных сшивок не обнаружили [15]. При определении числа сшивок, образованных пиридинолином в коллагене реберных связок и ахиллесова сухожилия крыс и человека [50], было показано, что у человека после 30 лет оно уменьшается, а у крыс после наступления зрелости растет. Основные типы сшивок — оксилизинонорлейцин (ОЛНЛ) и диоксилизинонорлейцин (ДОЛНЛ) с возрастом не меняются [81], т. е. образование поперечных сшивок в коллагене не является, по-видимому, первичной причиной старения [46]. Было высказано предположение, что уменьшение растворимости коллагена с возрастом может определяться стабилизацией лабильных сшивок. Для того чтобы установить, меняется ли количество поперечных сшивок с возрастом, необходимы дальнейшие исследования.
Особый интерес в связи с этим представляют три типа реакций. Первый — это реакции моносахаридов, глюкозы и галактозы, с альдегидами, образовавшимися из лизиновых и оксилизиновых остатков. В коже быка интенсивность этих реакций с возрастом увеличивается. Поскольку упомянутые здесь гексозильные соединения не могут образовывать связи с другими α-цепями, в результате этих реакций уменьшается число потенциальных мест для образования сшивок. Роль происходящих изменений неясна, но, возможно, они ответственны за повышенную хрупкость кожи и костей в старческом возрасте.
Второй тип реакций — взаимодействие аллизина с оксилизином с образованием альдимина или взаимодействие оксиаллизина с оксилизином либо с лизином с образованием кетоаминов, более стабильных, чем альдимины. Доля таких поперечных сшивок в сухожилиях человека, быка и крысы в период их роста увеличивается, но затем уменьшается. Эти изменения могут регулироваться уровнем лизилгидроксилазы, который в свою очередь зависит от других факторов.
Третий тип реакций — определение сшивок путем восстановления 3Н-боргидридом. С возрастом количество включающегося трития уменьшается. Возможно, причиной этому служит уменьшение доли таких сшивок. Вместе с тем причиной уменьшения включения трития может быть то, что эти сшивки в старческом возрасте становятся более стабильными и поэтому не восстанавливаются.
В ранний период развития в тканях меняются не только число и стабильность поперечных сшивок, но также и типы коллагена. Как было показано ранее [19], в коже и, возможно, в других тканях изменяется соотношение коллагена типа I и III. Обычно в культуре in vitro хондроциты синтезируют коллаген типа II, но если их обработать бромдезоксиуридином, аналогом тимидина, то они синтезируют тип I и другой тип коллагена, которого в тканях в норме нет [45]. Коллаген типа I синтезируют также старые хондроциты. Если в связках обычно синтезируется коллаген типа II, то в связках суставов при остеоартрите появляется коллаген типа I [53]. Было бы существенно выяснить, по этой ли причине происходит уменьшение в старческом возрасте коллагенового матрикса при остеопорозе. Может ли произойти замена синтеза остеобластами коллагена типа I на синтез коллагена какого-либо другого типа? При врожденной болезни — osteogenesis imperfecta — при которой кости становятся очень хрупкими, фибробласты кожи в культуре синтезируют в большом количестве коллаген типа III. Некоторые связанные с коллагеном заболевания возникают из-за уменьшения уровня специфических ферментов, необходимых для его синтеза [42]. Происходит ли при этом сдвиг в синтезе или ингибирование синтеза коллагена типа I, неизвестно. Любое из этих изменений может повлиять на способность матрикса содействовать кристаллизации апатита, в результате чего кость может стать более хрупкой, так как известно, что все типы коллагена, кроме типа I, образуют аморфные волокна.