Возбудитель сибирской язвы относится к генетически гомогенным патогенным микроорганизмам (genetically homogeneous pathogens). R Keim et al. (2009) считают, что это вызвано короткой эволюционной историей микроорганизма, исключающей накопление мутационного полиморфизма и наличием спогювой фазы в его жизненном цикле. Большинство мутаций в генах любого вида образуются во время циклов репликации хромосомы. Спора же позволяет существовать В. anthracis годами, не вовлекаясь в процесс деления, необходимый для поддержания вегетативных клеток.
Для изучения молекулярной эпидемиологии возбудителя сибирской язвы используют два подхода: многолокусный анализ варьирующих по числу тандемных повторов (multiple locus VNTR analysis, MLVA) (Keim P. et al., 2060); и анализ полногеномного полиморфизма отдельных нуклеотидов (single nucleotide polymorphism, SNP, снипсы) (Van Ert M. N. et al., 2007).
MLVA-анализ штаммов В. anthracis. С конца 1990-х гг. спосоо популярен среди исследователей, занимающихся выявлением межштаммовых различий В. anthracis. Он основан на чежштаммовом статистическом анализе VNTR. Подробно способ описан в работах P. Keim et al. (2000) и К. L. Smith et al. (2002). VNTR представляют собой короткие нуклеотидные последовательности (12 п о.), образующие тандемы, ориентированные в одном направлении. VNTR встречаются в хромосомной и плазмидной ДНК В. anthracis и варьируют по длине у разных штаммов сибиреязвенного микроба (табл. 3.1).
| Размер по количеству повторов
Локуса | Размер повтора в нуклеотидахб | наименьший | наибольший | Количество аллелей | Индекс разнообразия (D)
vrrA | 12 | 2 | 6 | 5 | 0,50
vrrB1 | 9 | 15 | 23 | 5 | 0,32
vrrB2 | 9 | 11 | 15 | 3 | 0,34
vrrC1 | 36 | 4 | 12 | 6 | 0,55
vrrC2 | 18 | 17 | 19 | 3 | 0,50
CG3 | 5 | 1 | 2 | 2 | 0,35
pXO1-aat | 3 | 4 | 11 | 8 | 0,81
pXO2-at | 2 | 6 | 15 | 9 | 0,79
Avg | | | | 5,1 | 0,52
а — курсивом показаны маркеры, обнаруженные в ORP; б — vrrB-повторы не являются идентичными. Отдельные из них содержат множественные нуклеотидные различия; vrrC-маркеры содержат 9 вырожденных субповторяюгцихся структур; D — индекс разнообразия подсчитывается как 1—∑ (аллельная частота)2.
У В. anthracis от двух до шести копий VNTR расположены в пределах открытой рамки считывания гена, обозначенного как vrrA ^ variable region with repetitive sequence). Ген vrrA кодирует белок с ММ 30 кДа, гомологичный микрофилярному белку SHP2 оболочки паразитного червя Litomosoides carinii (Andersen G. L. et al., 1996). To, что ген эволюционно законсервирован среди бактерий, свидетельствует о функциональной активности кодируемого им белка, но эта функция не установлена (Jackson R J. et al., 1997). Ген vrrC кодирует полипептид ДНК-транслоказу (DNA translocase) и обычно содержит триплетный VNTR. Обнаруженный в хромосоме бактерии триплет VNTR указывает на локализацию в данном участке структурного гена (Keim R et al., 2009).
Такие локусы амлифицируют ся в ПЦР с использованием праймеров, комплементарных их фланкирующим последовательностям. Аллельные варианты VNTR-локусов хорошо разделяются в агарозном геле. Размер аллелей может быть установлен путем сопоставления со стандартными маркерами ММ. Их количественный анализ позволяет классифицировать различные штаммы В anthracis в зависимости от числа повторов и аллельных вариаций повторов. Сам факт присутствия VNTR-локусов в геноме разных видов бактерий, возможно, связан с тем, что ДНК-полимераза катализирует синтез нуклеиновой кислоты через короткий тандем повторяющихся последовательностей. Они и являются тем, что мы называем «VNTR» (Keim P. et al., 2009).