Когда к забуференному раствору сахарозы добавляют янтарную кислоту и гидрокарбонат натрия, жидкость вскипает. Раствор следует хорошо встряхнуть, чтобы вся углекислота выделилась, так как ее присутствие может сказаться на результатах эксперимента.
Растворите 0,1 г дихлорфенолиндофенола в 10 мл забуференного раствора сахарозы (без янтарной кислоты для обеих частей эксперимента). Растворяется это вещество не слишком хорошо, поэтому после тщательного перемешивания суспензию следует профильтровать.
11.5. Митохондрии
Митохондрии имеются во всех эукариотических клетках. Эти органеллы — главное место аэробной дыхательной активности клетки. Впервые наблюдал митохондрии в виде гранул в мышечных клетках Кёлликер в 1850 г. Позднее, в 1898 г., Михаэлис показал, что они играют важную роль в дыхании: в его опытах митохондрии вызывали изменение цвета окислительно-восстановительных индикаторов.
Число митохондрий в клетке очень непостоянно; оно зависит от вида организма и от природы клетки. В клетках, в которых потребность в энергии велика, содержится много митохондрий (в одной печеночной клетке, например, их может быть около 1000). В менее активных клетках митохондрий гораздо меньше. Чрезвычайно сильно варьируют также размеры и форма митохондрий. Митохондрии могут быть спиральными, округлыми, вытянутыми, чашевидными и даже разветвленными; в более активных клетках они обычно крупнее. Длина митохондрий колеблется в пределах 1,5-10 мкм, а ширина — в пределах 0,25-1,00 мкм.
11.6. Почему при столь больших различиях в длине митохондрий их ширина сравнительно постоянна?
Митохондрии способны изменять свою форму, а некоторые могут также перемещаться в особо активные участки клетки. Такое перемещение (которому способствует ток цитоплазмы) позволяет клетке сосредоточивать большее число митохондрий в тех местах, где выше потребность в АТФ. В других случаях положение митохондрий более постоянно (как, например, в летательных мышцах насекомых; рис. 11.13).
Рис. 11.13. Электронные микрофотографии летательной мышцы комнатной мухи (Musca), полученные с помощью трансмиссионного (А) и сканирующего (Б) электронного микроскопа. Видно, что каждая миофибрилла окружена полиморфными митохондриями
11.5.1. Строение митохондрий
Митохондрии можно выделить из клеток в виде чистой фракции с помощью гомогенизатора и ультрацентрифуги. После этого их можно исследовать в электронном микроскопе, используя для этой цели различные методики, такие, как изготовление срезов и негативный контраст. Каждая митохондрия окружена двумя мембранами; наружную мембрану отделяет от внутренней расстояние в 6-10 нм. Внутренняя мембрана заключает в себе полужесткий матрикс митохондрии; эта мембрана образует многочисленные гребневидные складки, так называемые кристы (рис. 11.14). Обрабатывая митохондрии ультразвуком и детергентами, можно отделить наружную мембрану от внутренней, что позволяет изучать структуру и функции каждой из них в отдельности. Однако даже и с помощью такой методики нам пока еще мало что удалось узнать о наружной митохондриальной мембране. Полагают, что она проницаема для веществ с молекулярной массой меньше 21 000 и что такие вещества через нее диффундируют. Кристы внутренней мембраны существенно увеличивают ее поверхность, обеспечивая место для размещения мультиферментных систем и облегчая доступ к ферментам, находящимся в митохондриальном матриксе. Внутренняя мембрана отличается избирательной проницаемостью, т. е. пропускает лишь определенные вещества. Известно, что активный транспорт АДФ и АТФ через внутреннюю митохондриальную мембрану осуществляют особые ферменты, называемые транслоказами. Метод негативного контрастирования, при котором окрашенными оказываются не сами структуры, а пространство вокруг них, позволил выявить присутствие особых "элементарных частиц" на той стороне внутренней митохондриальной мембраны, которая обращена к матриксу (рис. 11.14, Б и Д). Каждая такая частица состоит из головки, ножки и основания. Хотя микрофотографии свидетельствуют, казалось бы, о том, что элементарные частицы выступают из мембраны в матрикс, считается, что это артефакт, обусловленный самой процедурой приготовления препарата, и что в действительности они полностью погружены в мембрану. Головки частиц ответственны за синтез АТФ. Это АТФаза (ранее обозначавшаяся F1), обеспечивающая сопряжение фосфорилирования АДФ с реакциями в дыхательной цепи. В основании частиц, заполняя собой всю толщу мембраны, располагаются компоненты самой дыхательной цепи. Они размещены по отношению друг к другу строго упорядоченным образом. В митохондриальном матриксе содержится большая часть ферментов, участвующих в цикле Кребса и в окислении жирных кислот. Здесь же находятся митохондриальные ДНК, РНК и рибосомы, а также ряд различных не очень крупных белков (разд. 7.2.12).