Научное творчество П. оказало революционизирующее влияние на представления того времени о кровообращении и особенно о пищеварении, а его учение об условных рефлексах послужило фундаментом для последовательно материалистического подхода к изучению высших функций мозга животных и человека. Вслед за изучением хода нервов, ускоряющих работу сердца, П. исследовал регуляцию пищеварительной деятельности поджелудочной железы, предположив наличие в ней двойной иннервации. В 1876—78 установил, что между сосудами кожи и внутренних органов существуют антагонистические прессорно-депрессорные отношения, обеспечивающие поддержание в организме кровяного давления на постоянном уровне. В лаборатории при клинике Боткина П. сделал крупное открытие, положенное им в основу докторской диссертации: деятельность сердца регулируется четырьмя центробежными нервами — замедляющим и ускоряющим, ослабляющим и усиливающим. Затем П. перешёл к исследованию нервной регуляции пищеварения (продолжая тем самым свои ранние работы по секреторным нервам поджелудочной железы) и иннервации желёз желудка (опыты с мнимым кормлением , перерезкой пищевода и блуждающих нервов — эзофаго- и ваготомией). Выдающиеся успехи П. в этой области опираются как на разработку им основ хирургического (асептического) эксперимента, так и на творческое восприятие развиваемой Сеченовым и Боткиным идеи нервизма , утверждающей регуляторную роль нервной системы в осуществлении функций организма как в норме, так и при патологических состояниях. Опыты с созданием изолированного желудочка (называемого ныне павловским) позволили П. обнаружить две фазы желудочного сокоотделения: нервнорефлекторную (запальный, или аппетитный, сок) и гуморально-химическую. П. изучал также с помощью хронических фистул жёлчного пузыря физиологию печени, а на изолированной кишечной петле, полностью сохранявшей нормальную иннервацию, — механизм работы кишечника. Итогом этих исследований явились «Лекции о работе главных пищеварительных желёз» (1897).
Переход П. к изучению высшей нервной деятельности (ВНД) закономерен и обусловлен как общей направленностью исследований, так и его представлением о приспособительном характере деятельности пищеварительных желёз. Условный рефлекс, по П., — это наивысшая и наиболее молодая в эволюционном отношении форма приспособления организма к среде. Если безусловный рефлекс — сравнительно стабильная врождённая реакция организма, присущая всем представителям данного вида, то условный рефлекс — новоприобретение организма, результат накопления им индивидуального жизненного опыта. Основная заслуга П. в том, что, приступая к изучению ВНД, то есть психических реакций, он остался в роли последовательного и сознательного «чистого» физиолога, то есть материалиста, для которого душа и тело не составляют две раздельные сущности. Свою позицию П. блестяще изложил в речи «Экспериментальная: психология и психопатология на животных» (1903), а позднее развил в статье «Естествознание и мозг» (1910).
Нервные механизмы временных связей (психологи их называют ассоциациями), образующихся между любыми внешними воздействиями (или внутренними раздражениями, изменениями, состояниями) и безусловнорефлекторными реакциями организма; закономерности развития и угасания условнорефлекторной деятельности; открытие в коре больших полушарий торможения — антипода возбуждения; исследование разных типов (внешнее, внутреннее) и видов торможения; открытие закона иррадиации (распространения) и концентрации (то есть сужения сферы действия) возбуждения и торможения — основных нервных процессов; изучение проблемы сна в связи с представлением П. о наличии в коре больших полушарий головного мозга мозаики возбуждённых и заторможенных пунктов; установление фазовых состояний мозга, или «фаз сна», проливающих свет на явления сновидений и гипноза; болезненные нарушения сна, охранительная роль торможения, столкновение (ошибка) процессов возбуждения и торможения как средство формирования и изучения экспериментальных неврозов — таков неполный перечень наиболее крупных исследованных П. с сотрудниками проблем и сделанных в этих направлениях открытий. Учение П. о типах нервной системы , которое зиждется на представлении о силе, уравновешенности и подвижности процессов возбуждения и торможения (сильный, безудержный, возбудимый; сильный, уравновешенный, инертный; сильный, уравновешенный, подвижный; слабый, что соответствует 4 греческим темпераментам: холерическому, флегматическому, сангвиническому и меланхолическому), развивает и ставит на прочную основу физиологию эксперимента эмпирического наблюдения врачей (начиная с Гиппократа) о темпераментах. Экспериментальное обоснование и теоретическое осмысление получило и учение П. об анализаторах , о локализации функций в коре головного мозга, а также о системности в работе больших полушарий. Наконец, в учении о сигнальных системах П. показал специфическую особенность человека, заключающуюся в наличии у него, помимо первой сигнальной системы , общей с животными, также и второй сигнальной системы — речи и письма, то есть совокупности слышимых, произносимых и записанных словесных сигналов. Доминирование первой или второй сигнальной системы позволяет понять, по П., наличие у человека двух крайних типов ВНД — художественного или мыслительного.