Можливість висловити своє невдоволення зазіханням на їхній статус руські еліти отримали невдовзі після смерті Вітовта 1430 року. У наступній боротьбі за литовський престол, що переросла в громадянську війну, руська шляхта, очолена волинськими боярами, підтримала власного кандидата, князя Свидригайла. Його суперник, князь Сигізмунд, 1434 року завдав удару у відповідь, поширивши права та привілеї, гарантовані Городельською унією, на православну еліту Великого князівства, повернувши хід війни на свою користь. Незважаючи на те що князі та шляхта Волинської та Київської земель підозріло поставилися до намірів Сигізмунда, їхня підтримка Свидригайла послабшала, що дозволило встановити відносний мир у князівстві. Усунувши релігійну причину невдоволення руських еліт, литовський двір отримав більше можливостей для маневру у своїх майбутніх зусиллях з обмеження автономії руських земель та князівств.
1470 року великий князь литовський та король польський Казимир IV ліквідував останній залишок княжої доби — Київське князівство. За десять років по тому київські князі змовилися вбити Казимира та поставити одного зі своїх кандидатів, але їхній задум провалився, що призвело до арешту його ватажків та змусило решту заколотників утекти за межі князівства. З їхнім від’їздом було покладено край надіям на відновлення способу життя, пов’язаного з княжою традицією Київської Русі. На зламі XV–XVI століть не лише на політичній карті України, а й у її інституційному, соціальному та культурному ландшафті мало що нагадувало про часи двохсотлітньої давнини, коли Галицько-Волинська держава прагнула скинути монгольський сюзеренітет і стати повністю незалежним гравцем у регіоні. Хоча руське право та мова ще залишалися добре вкоріненими, вони почали втрачати своє колишнє домінування. Ці невід’ємні частини руської культури мали тепер конкурувати з латинськими впливами та польською мовою, яка посіла почесне місце у Великому князівстві Литовському після Кревської унії.
По всій Європі XVI століття ознаменувалося зміцненням королівської влади, централізацією держав та уніфікацією соціальних і культурних практик. Іншою стороною медалі було дедалі більше зростання аристократичної опозиції щодо сильної королівської влади, яка у випадку Польщі та Литви походила з аристократичних родів Великого князівства — у багатьох із них глибоко вкоренилася княжа традиція Київської Русі та Галицько-Волинської держави. Але в середині XVI століття опозиційні настрої литовсько-руської еліти щодо зростання королівської влади послабилися через збільшення зовнішньої загрози князівству, яку воно могло пережити лише з допомогою Польщі. Ця загроза походила зі сходу, де протягом XV століття зростала нова міжнародна потуга — Велике князівство Московське.
1476 року великий князь Іван III, який першим назвав себе царем, проголосив незалежність свого царства від Орди й відмовився сплачувати данину ханам. Він також розпочав кампанію зі «збирання руських земель», взявши Новгород та Твер і почавши претендувати на інші руські землі, що колись входили до складу Монгольської держави, у тому числі й території сучасної України. В останні десятиліття XV століття новостворене Московське царство та Велике князівство Литовське почали тривалий конфлікт за спадщину Київської Русі. Московія перейшла в наступ, і на початку XVI століття великі князі змушені були визнати зверхність царя над двома своїми колишніми територіями, Смоленщиною та Чернігівщиною. Це був перший випадок, коли Московське царство поширило свою владу на частину території нинішньої України.
Просування Московської держави на захід, зупинене литовськими князями на початку XVI століття, відновилося у його другій половині. 1558 року Іван Грозний, рішучий та харизматичний, але разом із тим ексцентричний, жорстокий і в результаті самовбивчий цар, напав на Лівонію, державу, що межувала з великим князівством і включала нинішні Латвію та Естонію, розпочавши Лівонську війну (1558–1583), що тривала чверть століття і втягнула Швецію, Данію, Литву і зрештою Польщу. 1563 року московські війська перетнули кордон князівства, захопивши Полоцьк і здійснивши рейди на Вітебськ, Шклов та Оршу (усі — у сучасній Білорусі). Ця поразка мобілізувала підтримку польсько-литовського союзу серед литовської знаті.