Заселення України — степових околиць уздовж середнього Дніпра, зображених на карті Томаша Маковського, про яку йшлося у попередньому розділі, — було спільним проектом волинських князів і дніпровських козаків. 1559 року Костянтин Острозький став київським воєводою — де-факто віце-королем величезних територій Наддніпрянської України. Його юрисдикція поширювалася на Київ і Черкаси, а до числа підопічних входили й козаки, які одночасно і сприяли, і перешкоджали подальшому заселенню степів зі своїми походами (з погляду одних — визвольними, з погляду інших — розбійницькими) проти татар і турків. Острозький ініціював перші спроби залучення козаків на військову службу — не стільки для використання їх як бойової сили, скільки для того, щоб прибрати їх із земель за порогами і встановити бодай якийсь контроль над цією непокірною юрбою. Лівонська війна збільшила попит на воїнів на кордоні з Московією, тож у 1570-ті роки було сформовано ряд козацьких підрозділів, один із яких налічував аж 500 вояків.
Реорганізація козаків з ополчення на службі в прикордонних урядовців у військові з’єднання під командуванням армійських офіцерів відкрила нову еру в історії козацтва. До вжитку увійшов термін «реєстрові козаки». Козаки, яких брали на військову службу й таким чином заносили до «реєстру», були звільнені від сплати податків та не підлягали юрисдикції місцевої влади. Також вони отримували платню. Звичайно, від охочих потрапити до реєстру не було відбою, але польська корона набирала на службу лише обмежену кількість, а їхні пільги діяли лише на період активної служби, так само лише за цей період сплачувалися й гроші. Але ті, хто не був включений до реєстру на початку або виключений з нього після завершення військової кампанії, відмовлялися зрікатися свого статусу, що породжувало численні суперечки між козаками та прикордонними урядовцями. Створення реєстру вирішило для уряду лише одну проблему, натомість породивши іншу.
1590 року польсько-литовський сейм постановив створити військо з 1000 реєстрових козаків для захисту прикордонних областей України від татар і нереєстрових козаків. Хоча король і видав необхідну постанову, з цього мало що вийшло. До 1591 року Україну охопило перше козацьке повстання. Козаки, які до цього спустошували турецькі володіння — Кримське ханство та Молдавію (залежну від Османської імперії), — спрямували свою енергію всередину країни. Вони повстали не проти держави, а проти своїх «хрещених батьків» — волинських князів, зокрема Януша Острозького та його батька Костянтина. Януш був старостою Білої Церкви — замку на південь від Києва, у той час як Костянтин «наглядав» за діяльністю сина. Батько та син Острозькі повністю контролювали регіон. Ніхто з місцевої знаті не смів кинути виклик могутнім князям, які займалися розширенням своїх володінь за рахунок земель, захоплених у дрібної шляхти. Ніхто, крім козаків.
Один із тих дрібних шляхтичів, хто став жертвою Острозьких, Криштоф Косинський, виявився також і козацьким отаманом. Коли Острозький захопив землю Косинського, подаровану йому королем, той не став марнувати час на даремні скарги до короля, а напав на замок Білої Церкви, де була штаб-квартира молодого Острозького. Приватна армія, зібрана Острозькими та іншим вихідцем із Волині, Олександром Вишневецьким, зрештою завдала йому поразки. Князям вдалося придушити повстання, не звертаючись по допомогу до королівської влади. За іронією долі «хрещені батьки» козаків покарали своїх неслухняних дітей за допомогою інших козаків, які перебували в них на службі. Більш відомим серед цих лояльних князям козацьких отаманів був Северин (Семерій) Наливайко. Він повів козаків Острозького у бій проти війська Косинського, а потім зібрав розсіяних козаків у степах Поділля і повів їх якнайдалі від володінь Острозьких.
Однак існувала межа, до якої Острозькі могли контролювати козацькі заколоти або маніпулювати ними. Козаки обирали власного командувача, із яким ішли в бій, але, щойно похід закінчувався, були вільні вигнати його або стратити, якщо він діяв проти їхніх інтересів. Крім того, існували розбіжності всередині самого козацтва. Реєстрових козаків набирали з класу козаків-землевласників, які жили в містах та поселеннях між Києвом та Черкасами.