Зимой 1390 г. после десятидневной осады замок пал под натиском армии короля Ягайло, повздорившего со своим двоюродным братом великим князем Витовтом. В том же году польский король предоставил Берестью самоуправление на принципах магдебургского права, а вскоре вернул его прежнему «хозяину». В XV в. Берестье стало важным торговым и ремесленным, политическим и культурным центром польско-литовского государства. В декабре 1409 г. во время Великой войны с крестоносцами в Берестейском замке проходило тайное совещание польского короля Владислава Ягайло и великого князя литовского Витовта с сыном Тохтамыша ханом Джелаладином. Обсуждался план похода против Тевтонского ордена. Результатом его реализации стала Грюнвальдская битва, в которой наряду с польскими, русскими, литовскими полками приняла участие и берестейская хоругвь. В честь одержанной победы Витовт в 1411 г. основал в городе монастырь августинцев и костел Святой Троицы. Через два года в результате административной реформы город стал центром Берестейского староства в составе Трокского воеводства, а к 1440 г. — одним из главных городов Великого княжества Литовского, местом проведения съездов и сеймов. Польский хронист Ян Длугош называл Берестье «пристанью и воротами в литовские и русские земли». В конце столетия здесь было 5 тысяч жителей и 928 застроенных участков. Местные купцы активно участвовали в международной торговле, контролировали финансовые потоки, город прославился великими Берестейскими ярмарками, а княжество измеряло длину берестейским аршином.
В 1500 г. крепость выдержала осаду 15-тысячной орды крымского хана Менгли-Гирея. Однако посад был полностью разграблен и сожжен дотла. На восстановление его из руин ушли следующие десять лет. В 1525 г. в результате пожара «на корень выгорел» Берестейский замок, погибли все оружие и припасы.
К середине XVI в. Берестье вновь стало крупным торгово-ремесленным центром. В 1563 г. берестейский староста Николай Радзивилл Черный основал здесь первую на территории современной Беларуси типографию, а три года спустя город стал центром Берестейского воеводства. К тому времени он состоял из трех частей: замка, города, или «места», на острове, окруженного водами Буга и Мухавца, а также Замухавечья, расположенного на правом берегу рукава реки. Центральная часть «места» была укреплена оборонительной стеной, периферийная — валом.
Заново отстроенный замок представлял собой достаточно мощное фортификационное сооружение с валом и пятью башнями. В старой браме висел ратный колокол — «звон великий». Основу оборонительной линии составляли объемные двухъярусные стены, внутри которых находились жилые и служебные помещения, предназначенные для «схованья» населения и хранения запасов. На верхний ярус стен, где проходила боевая галерея, вели лестницы. Под башнями, как водится, имелись камеры для содержания заключенных — «вязней». На внутренней территории располагались цейхгауз, королевские конюшни и жилые дома европейского типа с каминами, залами для приемов и застекленными окнами. Некоторые здания были связаны с башнями крытыми переходами. В арсенале находились металлические доспехи на 100 человек, 12 пушек, большая мортира, 96 гаковниц и 7 железных «ручниц», 360 ядер, формы для их отливки, холодное оружие, болты для арбалетов, пороховая мельница. Под землей к реке были проложены потайные деревянные трубы, по которым с помощью специальных помп в крепость во время осады могла подаваться вода. От водяной мельницы могли работать и механическая «ступа на толчение пороху», и сукновальня. За оружием и замковыми сооружениями присматривали слуги и ремесленники: пушкарь, плотник, бондарь, кузнец, слесарь, каменщик, печник, столяр, а также пивовары, мельники и другие. Их называли «людьми замка», и они были освобождены от подати в городскую казну. Водонасосное устройство обслуживалось отдельным специалистом — «рурмистром». От Замухавечья замок отделял водяной ров, соединявший Мухавец с Бугом.
В мирное время «штатный гарнизон» состоял из 12 сторожей и 12 наблюдателей-«кликунов». Защита города и замка возлагалась на мещан и жителей волости. В случае необходимости присылали дополнительный воинский контингент. Так, во время Ливонской войны в июле 1566 г. здесь находился кавалерийский отряд в составе 600 человек. Горожане, входившие в цеховые военные объединения, согласно уставам своих цехов обязаны были иметь «супольную армату…бубен и хоругву… для обороны места». Каждый полк со своим оружием непременно принимал участие в военных смотрах.