Под прямое подозрение попали приближенные к царевичу люди: начальник петербургского адмиралтейства А. В. Кикин, духовник Я. И. Игнатьев, камердинер Иван Афанасьев, мать царевича — инокиня Евдокия Лопухина и многие другие. На допросах, проходивших в Петропавловской крепости в Санкт-Петербурге, Алексей назвал всех, кто был вовлечен в его побег. При этом свою роль Алексей определял как зависимую и подневольную. Розыск в суздальском монастыре, куда была заточена Евдокия, показал, что многие насельники монастыря сочувствовали бывшей царице. В их числе оказались любовник Евдокии Степан Глебов, игуменья монастыря Марфа, ключарь Федор Пустынный, несколько монахинь. Более того, поддержку Евдокии выражал епископ Ростовский и Ярославский Досифей. Все они были казнены как участники заговора против царя. Евдокия Лопухина была предана наказанию кнутом и сослана на север, в староладожский монастырь.
После завершения допросов и казней основных преступников Алексей надеялся на дальнейшую спокойную жизнь вдалеке от государственных волнений и перипетий. Об этом он писал своей любовнице Ефросинье Федоровой еще в письме от 3 (14) февраля 1718 года, в день своего отречения: «Слава Богу, что нас от наследия отлучили, понеже останемся в покое с тобою, дай Боже, благополучно пожить с тобою в деревне, понеже мы с тобою ничего не желали, только б жить в Рожествене. Сама ты знаешь, что мне ничего не хочется, только с тобою до смерти дожить». Ефросинья сопровождала его за границу, ее уговоры стали одной из причин возвращения царевича. Однако Алексея доставили в Россию быстрее, Ефросинья же была беременна, и для нее обратная поездка растянулась до апреля 1718 года. По ее возвращении судьба Алексея была предрешена.
На допросах Ефросинья дала показания, изобличающие царевича в намерении воспользоваться войсками зарубежных монархов и низвергнуть отца с российского престола. От Ефросиньи следователи получили письма, написанные царевичем в адрес сенаторов и архиереев во время пребывания за границей. В них он указывал на свое вынужденное временное отлучение от отечества и призывал не верить слухам о своей гибели. Об этих письмах царевич ранее на допросах не упоминал. Ефросинья вспомнила и о других тайных письмах, которые царевич писал одному из архиереев (к кому именно, она не помнила), а также о многочисленных жалобах на отца своего императору Священной Римской империи.
С ее показаний следователями было записано:
«Сказывал си он же Царевич о возмущении, что будто в Мекленбургии в войске бунт, и то будто он слышал из курантных ведомостей, а по том ей же сказывал, уже де бунт в городах близко Москвы, и то из писем прямых, а от кого не сказал, и радовался тому, и говаривал, вот же Бог делает свое. А про побеге де Царевичев ведали, что он же си сказывал, четверо, в том числе, и Царевна Марья Алексеевна [еще Кикин, Афанасьев и Дубровский. — Прим. автора], а сказал де си так, что я де хочу скрытца. Он же говаривал: я де старых всех переведу, а изберу де себе новых по своей воле. Он же де когда слыхал о каких видениях, или читал в курантах, что в Петербурхе тихо и спокойно, тогда говаривал, что то не даром, может быть, либо отец мой умрет, или бо бунт будет.»
На очной ставке Ефросинья повторила свои показания, а царевич поначалу «запирался» (возражал), но затем во многом сознался. Обнаруженные факты стали предметом судебного рассмотрения. 13 (24) июня 1718 года царь объявил духовенству и светским чинам о передаче дела царевича на их суд. Отказ самостоятельно вынести решение Петр I объяснил желанием избежать ошибки и разрешить дело максимально объективно. В своем обращении царь сравнил ситуацию личного рассмотрения преступного деяния своего сына с предвзятостью врача при лечении собственной болезни.
В состав Верховного суда вошли светские чины — министры, сенаторы, военные и гражданские сановники, всего 127 человек, и этот суд потребовал от подсудимого дать ответы на дополнительные вопросы о его преступном замысле. Получив эти дополнительные ответы и пояснения царевича, министры и сенаторы повелели сделать выписки из Божественного Писания обоих Заветов, а также из Соборного уложения 1649 года и военного артикула, касающиеся определения наказания, «чего оные преступления достойны».
В Соборном уложении таким образом был отмечен двойной состав преступления. Первый:
«Будет кто каким умышлением начнет мыслить на государское здоровье злое дело, и про то его злое умышление кто известит, и по тому извету про то его злое умышление сыщется допряма, что он на царское величество злое дело мыслил, и делать хотел, и такова по сыску казнить смертию» (статья 1 главы 2). Второй: «Также будет кто при державе царского величества, хотя Московским государством завладеть и государем быть и для того своего злого умышления начнет рать собирать, или кто царского величества с недруги начнет дружиться, и советными грамотами ссылаться, и помочь им всячески чинить, чтобы тем государевым недругом, по его ссылке, Московским государством завладеть, или какое дурно учинить, и про то на него кто известит, и по тому извету сыщется про тое его измену допряма, и такова изменника по тому же казнити смертию» (статья 2 главы 2).»