Нас в данный момент интересует, что транскрипционные факторы очень хорошо умеют распознавать генетический текст, но все по-разному. Одни распознают текст очень специфично, и тогда не требуется слишком большой сборки из транскрипционных факторов и кофакторов, а другие — менее специфично, и тогда для повышения точности транскрипции генов могут понадобиться еще какие-то белки-помощники и еще один кофактор, которые осуществили бы «тонкую настройку».
Понятие транскрипционного фактора появилось в конце 1980-х годов, а чуть позже исследователи обнаружили целое семейство транскрипционных факторов, белковая структура которых имела повторяющиеся элементы, и эти элементы получили название цинковые пальцы.
Нуклеазы типа цинковых пальцев
Свое странное название эти фрагменты белковых молекул получили за характерную трехмерную структуру и наличие в их составе ионов цинка. Цинковый палец представляет собой последовательность аминокислот, состоящую из пары близко расположенных цистеинов (аминокислотных остатков), потом следует промежуток в полтора-два десятка любых аминокислот, и опять идут два близко расположенных цистеина или гистидина. Ионы цинка стабилизируют, удерживают эту конструкцию, связываясь координационными связями с двумя близко расположенными цистеинами. Представьте себе веревку с четырьмя завязанными узелками — это будут цистеины или гистидины. А теперь пальцами притяните все узелки в одну точку. Ваши пальцы сыграли роль иона цинка. У вас получатся три петли, которые можно назвать тремя пальцами. Так вот, каждый палец достаточно точно узнает три-четыре нуклеотида ДНК, расположенные в определенном порядке, и связывается с ними. Три пальца уже распознают девять-десять нуклеотидов — определенное слово генетического текста.
Рис. 6. Нуклеазы типа цинковых пальцев
Среди трех миллиардов букв, составляющих генетический текст ДНК, группа из трех-четырех букв попадается довольно часто. А вот если мы возьмем сочетание пяти-шести цинковых пальцев, которые однозначно определят последовательность примерно пятнадцати-семнадцати нуклеотидов генетического текста, то с вероятностью девяносто девять целых и девять десятых процента это будет уникальная последовательность среди трех миллиардов букв.
Конечно, для того чтобы этого добиться, тоже потребовалась большая работа. Цинковые пальцы были исследованы вдоль и поперек, и для каждого пальца специалисты изучили специфичность распознавания ими определенных сочетаний нуклеотидов. С помощью этого знания, используя рекомбинантные технологии, исследователи смогли создать искусственные сочетания цинковых пальцев, которые бы распознавали с полной определенностью нужный фрагмент генетического текста внутри клетки.
Сейчас изучены шестьдесят четыре цинковых пальца, которые могут распознавать шестьдесят четыре различные комбинации из трех нуклеотидов, входящих в последовательность ДНК. Исследователи научились достаточно точно распознавать очень конкретные слова генетического текста, с точностью до одной буквы, до одного нуклеотида, — и все это внутри живой клетки. Теперь, опять-таки с помощью рекомбинантных технологий, нужно было к распознающей части цинковых пальцев, которые у нас есть, дополнительно синтезировать и вставить в ту же самую белковую молекулу специальный белковый фрагмент, который обладает нуклеазной активностью. Это значит, что он может нарушать ковалентные связи в молекуле ДНК, то есть разрезать нить ДНК в том месте, где цинковые пальцы распознали определенную последовательность букв генетического текста.
Если мы знаем, какой конкретно генетический текст нужно исправить из-за наличия в нем мутации, и есть определенный нуклеотид, который нуждается в замене, то следующим шагом должна быть эта самая замена с помощью гомологичной генетической рекомбинации.
Технология использования нуклеаз типа цинковых пальцев активно развивалась в первое десятилетие XXI века. Очень большой вклад в разработку нуклеаз цинковых пальцев и связанных с ними методов редактирования генома внес американский генетик российского происхождения Федор Урнов. Однако у этого метода обнаружились и некоторые недостатки. Ограниченное количество известных цинковых пальцев значительно сужает применимость подхода для распознавания любого генетического текста. К тому же эта технология оказалась очень трудозатратной и дорогостоящей, так как для каждой конкретной мишени надо было разрабатывать особую нуклеазу цинковых пальцев, и на это уходило шесть — девять месяцев.