Мы предположили, что обратная транскрипция, которая создает мутантную кДНК-копию перестроенного V(D)J-yчастка, начинается в особом районе, в «праймерном» сайте ниже V(D)J около Ei/MAR участка (рис. 5.6), и продолжается справа налево по направлению к кэп-сайту (5'-конец про-мРНК матрицы). Цезар Мильштейн с коллегами экспериментально показали на трансгенных мышах, что «локус-специфическое устройство», Ei/MAR, важно для соматического гипермутирования, тогда как V(D)J-кодирующий участок и промотор можно заменить копиями гемоглобинового гена без ущерба для мутации. Мы считаем Ei/MAR «локус-специфичным устройством», необходимым для стыковки RT-мутаторсомы с V(D)J-геном и ограничения мутаций этим геном. (В настоящее время мы экспериментально проверяем это предположение.) Мы также считаем, что мутантная кДНК-копия V(D)J-yчастка встраивается в хромосому и замещает исходный, немутированный V(D)J (на рисунке это показано петлеобразной стрелкой.). Возможность подобной генетической интеграции экспериментально продемонстрирована у многих организмов и называется гомологичной рекомбинацией, так как похожие ДНК-последовательности совмещаются, а за этим следует рекомбинация ДНК. Указанные предположения гарантируют, что участки выше промотора и ниже константного участка защищены от мутаций, а некодирующая ДНК в непосредственном соседстве с V(D)J мутирует с очень высокой частотой (тот же уровень ошибок, что и при транскрипции и обратной транскрипции — примерно 10-3—10-4 на цикл копирования пар оснований, рис. 5.2)
Таким образом, правила копирования ДНК- или РНК-матриц и склонные к ошибкам процессы синтеза РНК и кДНК полностью удовлетворяют «требованиям» соматического мути-рования. Существует единственное направление, в котором могут синтезироваться ДНК-копии по матрице про-мРНК — обратно к сайту начала транскрипции (кэп-сайту). Если синтез кДНК начинается в Ei/MAR-участке или рядом с ним, это автоматически обеспечит мутирование V(D)J без риска мутирова-ния промотора и константного участка. Для того чтобы «обессмертить» мутантную последовательность в организме, потребуется гомологичная рекомбинация для встраивания мутант-ной кДНК-копии в хромосомную ДНК, что обеспечит передачу ее последующим поколениям дочерних клеток.
У мышей 5', или верхняя, граница мутаций находится около кэп-сайта для Н цепей и в L-V интроне для легких цепей (рис. 5.5). Расположение этих сайтов согласуется с двумя главными точками, где заканчивается синтез кДНК, а) когда обратная транскриптаза подходит к 5'-концу матрицы про-мРНК, или б) около L-V-интрона, так как интрон может быть удален при сплайсинге, который превращает про-мРНК в мРНК.
Данные о соматическом мутировании не соответствуют традиционной модели, основанной на ДНК, но предсказываются RT-моделью
Какие еще данные свидетельствуют в пользу RT-модели и отличают ее от других мутационных моделей, которые мы определяем как «основанные на ДНК» (они зависят от локального склонного к ошибкам синтеза ДНК вблизи перестроенного V(D)J-участка)? Прежде всего, одно общее соображение: нет доказательств существования механизма, который избирательно прекращает синтез ДНК. Однажды начавшись, синтез продолжается до тех пор, пока не достигнет конца матрицы. Таким образом, для подтверждения таких моделей потребовалось бы придумать и экспериментально доказать особые правила синтеза ДНК.
Есть еще две группы данных, которые не соответствуют моделям, основанным на ДНК, но которые предсказываются RT-моделью. Они получены в лабораториях Патрисии Гир-харт и Эрика Сейсинга (Seising). В одних экспериментах сразу ниже перестроенного V(D)J-участка (между VDJ и J на рис. 5.6) была помещена так называемая «репортерная» последовательность. Оказалось, что эта последовательность подавляла появление мутаций в VDJ-участке. Такой результат несовместим с моделями, основанными на ДНК, но согласуется с RT-моделью. Действительно, репортерная последовательность — короткий участок ДНК, кодирующий транспортную РНК (тРНК), которая складывается в характерную трехмерную форму (транспортные РНК участвуют в синтезе белка, они переносят аминокислоты). Согласно RT-модели, синтез кДНК должен остановиться до V(D)J-участка, поскольку обратная транскриптаза не может продолжить движение через тРНК-структуру. Два других свойства тРНК также могут прекратить обратную транскрипцию. Первое, последовательность тРНК могла высвободиться из про-мРНК и, таким образом, РНК-матрица, по которой RT-мутаторсома копирует РНК в кДНК, обрывается. Второе, химическая модификация азотистых оснований в тРНК может подавлять синтез кДНК RT-мутаторсомой.