В 1861 году Менделеев приступил также к преподаванию в Петербургском втором кадетском корпусе, в Корпусе инженеров путей сообщения, в Военно-инженерном училище и в Военно-инженерной академии. Одновременно он взял на себя редактирование большого курса общей технологии. Редактирование по существу состояло в полной замене взятого первоначально за основу немецкого руководства новым текстом, связанным с изучением русской промышленности. Первый выпуск, вышедший в 1862 году, был посвящен переработке сельскохозяйственных продуктов. Весь курс проникнут характерным для всех работ Менделеева стремлением поднять научно-технический уровень русской промышленности на основе последовательного применения передовых химико-технологических знаний.
Вскоре практическое применение науки охватило и другие отрасли. Менделеев купил небольшое имение Боблово вблизи Клина (90 километров от Москвы) и, проводя здесь долгие месяцы, вел важные исследования по применению удобрений в земледелии. Менделеев придавал этим опытам большое значение. В старости, подводя итог своим трудам, Менделеев на полях одной из работ, описывавших его труды в области сельского хозяйства, начатые в 60-е годы, писал: «Они важны для меня потому, что оправдывают все мое дальнейшее отношение к промышленности». Менделеев докладывал о своих экспериментах по применению удобрений на научных собраниях и побудил принять участие в работах ряд молодых исследователей, среди которых был К. А. Тимирязев — в будущем крупный исследователь в области физиологии растений. Следуя указаниям Менделеева, Тимирязев организовал в Симбирской губернии один из первых опытных сельскохозяйственных участков. Указывая на важность удобрений, Менделеев одновременно видел, какие широкие перспективы открываются перед земледелием созданием новых сортов культурных растений. Он писал: «При создании новых, человеку наиболее пригодных и выгодных пород растений и животных… наблюдая и дружа с природой, — ее обгоняют и творят в ней несуществующее… Если можно было дойти до производства тюльпанов желаемого цвета, то можно дойти и до производства из рябины — фрукта на славу по широте спроса, по вкусу и пользе…»
В 1865 году Менделеев защитил докторскую диссертацию «О соединении спирта с водой». Речь об этой работе будет идти дальше, когда мы подробнее остановимся на основных химических открытиях Менделеева. Работе «О соединении спирта с водой» принадлежит среди них почетное место.
В 1865 году Менделеев стал профессором Петербургского университета по кафедре технической химии (годом раньше — профессором Петербургского технологического института по кафедре химии). Он все больше развертывал свою научную деятельность в области технологии различных отраслей русской промышленности и, в частности, начал в эти годы изучение эксплуатации нефтяных источников, приведшее впоследствии к важным практическим и теоретическим результатам.
Два года спустя Менделеев получил кафедру неорганической химии в Петербургском университете. Почти четверть века она оставалась основным центром его педагогической и исследовательской работы. Менделеев решил свой курс неорганической (общей) химии читать на основе новых идей, объединить сумму химических знаний того времени в стройную дисциплину, пронизанную единым принципом, не только объясняющим особенности всех известных тогда химических элементов, но позволяющим даже указать свойства еще не открытых элементов. Открытие этого принципа явилось величайшей заслугой Менделеева. Оно было совершено в 1869 году.
В начале 1869 года Менделеев послал ряду химиков «Опыт системы элементов, основанной на их атомном весе и химическом сходстве». В марте И. А. Меншуткин прочитал в Русском химическом обществе доклад Менделеева (по болезни не присутствовавшего на заседании). «О соотношении свойств с атомным весом элементов». Здесь Менделеев показал, что в ряду химических элементов, расположенных в порядке возрастания их атомных весов, химические свойства повторяются периодически через определенное число элементов.
Менделеев рассказывает, что он пришел к этому открытию, стремясь связать массу и химические свойства. Все тела природы, говорит Менделеев, обладают определенной массой. Между различными телами мы видим прежде всего количественные различия: одни тела обладают большей массой, другие меньшей. Наряду с этим мы видим также качественные различия между телами, и, отыскивая основу таких различий, мы приходим к качественно различным химическим элементам. Отсюда, говорит Менделеев, появляется мысль, что между массой и свойствами химических элементов существует связь и эту связь можно отыскать. «Искать же чего-либо, хотя бы грибов или какую-либо зависимость, нельзя иначе, как смотря и пробуя. Вот я и стал подбирать, написав на отдельных карточках элементы с их атомными весами и коренными свойствами, сходные элементы и близкие атомные веса, что быстро и привело к тому заключению, что свойства элементов стоят в периодической зависимости от их атомного веса, причем, сомневаясь во многих неясностях, я ни минуты не сомневался в общности сделанного вывода, так как случайности допустить было невозможно».