Большой интерес для Докучаева представляла теория Рупрехта. Докучаев видел в ней много правильных положений, но изучение черноземной степи и анализ многочисленных образцов почв из разных районов дали ему неопровержимые доказательства изменения чернозема в пространстве, в первую очередь, в связи с изменениями климата. Таким образом, гипотеза Рупрехта, несмотря на ряд ее достоинств, оказалась научно не состоятельной, так как Рупрехт отрицал изменение чернозема в зависимости от изменения климата.
Докучаев установил единицу измерения качественных и количественных изменений чернозема в пространстве и критерий для его оценки. Это была необходимая основа для классификации чернозема. Различия черноземов были хорошо видны из их морфологических описаний (описаний внешних признаков), но Докучаев справедливо считал, что эти описания сами по себе не могут считаться убедительными, так как содержат, как и все описания, подчас слишком много субъективного. Надо было найти какой-то более объективный критерий классификации. И Докучаев его нашел. В качестве такого критерия он взял количество содержания в почве органического вещества — гумуса. Было сделано очень много анализов гумуса. Внимание Докучаева к этим анализам совершенно понятно: чернозем прежде всего ценен высоким содержанием гумуса, который в известной мере обусловливает исключительное плодородие черноземных почв.
Вполне обоснованно Докучаев решил, что разделение черноземов на группы, то есть классификации черноземов, лучше всего и правильнее всего построить именно на определении количества содержащегося в них гумуса. Такой подход к оценкe почв был для науки того времени большим шагом вперед. Не отрывая почву от природы, учитывая, что «природа не математика», Докучаев в то же время стремился подойти к почве «с весами в руках» и использовать новейшие достижения других наук и, в частности, органической химии для более прочного обоснования своей теории.
У Докучаева родилась мысль провести «изогумусовые полосы», то есть разделить черноземную зону на ряд подзон с различным, закономерно меняющимся содержанием гумуса в почве. Эга идея захватила Докучаева, и «изогумусовые полосы» были установлены и изображены на карте. Явно нащупывалась, как он полагал, связь этих полос с определенными климатическими поясами. Таким строго научным и остроумным способом была безоговорочно опровергнута гипотеза Рупрехта, отрицавшая влияние климата на характер и свойства черноземов и почвы вообще.
Через сорок лет после опубликования работ Докучаева академик К. Д. Глинка писал об «изогумусовых полосах»: «Дальнейшие, более детальные исследования показали, что столь правильных соотношений в количестве гумуса в черноземах Европейской части СССР не существует, но в общем схема Докучаева все же близка к действительности». Но если в правильности идеи Докучаева не сомневались через сорок лет после того, как она была высказана, то с современниками Докучаеву пришлось по поводу нее выдержать ожесточенные бои.
Когда обработка материалов уже близилась к концу и, казалось, скоро можно будет пожинать плоды тяжких трудов, Докучаев в своих построениях увидел ряд противоречий. Обнаружилось, что на Украине, в районе Днепровских порогов, где на поверхность выходят граниты и другие массивно-кристаллические породы, а также различные продукты их выветривания, в черноземах, образовавшихся на этих породах, содержание гумуса на несколько процентов ниже, чем в других районах черноземной зоны той же широты. Кроме того, многие ученые и в их числе знаменитый русский геолог академик А. П. Карпинский высказали предположение, что черноземы вообще могут образовываться только на лессах, то есть на таких пылевато-глинистых материнских породах, в которых содержится много углекислой извести. Такое мнение шло в разрез с теорией Докучаева о влиянии климата на характер почвы.
Несмотря на то, что работа была близка к завершению, Докучаев, не колеблясь, отложил окончательное оформление своего труда и летом 1881 года решил «еще раз посетить юго-западную Россию и заглянуть в ее наиболее глухие уголки». Снова началась полевая работа, неустанные походы, сбор новых образцов, или, как любил говорить Докучаев, «образчиков». Нелегко было организовать эту поездку: своих денег у Докучаева не было, а ученые общества были бедны. Но интерес к работам Докучаева был так велик, что Петербургское общество естествоиспытателей нашло возможным выделить для этой экспедиции из своих, как признавал Докучаев, «крайне скудных денежных ресурсов необходимые средства для окончательного решения упомянутых выводов».