С другой стороны, король не препятствовал росту влияния пресвитеров и постепенному отстранению епископов от церковной власти. В 1592 году он утвердил акт парламента Шотландии о пресвитерианской реформе церкви. Кульминацией пропресвитерианской политики Якова стал его поход в 1594 году в сопровождении богослова и реформатора Эндрю Мел вилла и лидеров ультрапротестантов против не сдержавших клятву северных графов, завершившийся их изгнанием из с граны и конфискацией владений. Правда, Хантли скоро вернулся и, после его формального перехода в пресвитерианство, был восстановлен в правах. Эти действия отчасти устранили католическую угрозу в Шотландии.
Подчинение свободолюбивого Хайленда шло с переменным успехом. В 1598 году Яков уполномочил группу представителей равнинной Шотландии (Лоуленда), называвшуюся «Пять авантюристов», колонизовать и цивилизовать «наиболее варварский остров Льюис». Искореняя «варварство», они могли действовать не «по договоренности» с местными жителями. Начало акции было успешным, но затем колонисты были изгнаны обитателями острова под командованием Мердока и Нейла Маклеода. Вторая попытка, в 1605 году, покорить клан Маклеодов закончилась с тем же результатом, и лишь третья, в 1607 году, в какой-то мере удалась. В 1609 году был принят так называемый «Устав Ионы», согласно которому протестантские священники получали права в приходах Хайленда, а вожди северных кланов должны были посылать своих наследников для изучения английского языка в протестантские школы равнинной Шотландии. Так начался процесс, направленный на искоренение гэльского языка и разрушение, обернувшееся на деле приспособлением, традиционной культуры. Как видно, Яков не терпел любого проявления независимости, что вызывало сопротивление даже среди родственников — кузен короля Патрик Стюарт, граф Оркни, выступил против «Устава Ионы» и был заключен в тюрьму. Его побочный сын Роберт возглавил восстание против Якова, но потерпел поражение. Граф и его сын были повешены, а острова Оркни и Шетланд были присоединены к короне.[18]
Ободренные королевской поддержкой пресвитерианской церкви, активизировались и ультрапротестанты. Они выступали за запрет торговли с католической Испанией, проведения ярмарок по выходным и театральных постановок, открыто критиковали короля и его министров за пренебрежение божественными установлениями, организовывали заговоры. Но так ли они были опасны? В 1600 году Джон Рутвен, 3-й граф Гоури, убежденный пресвитерианин, встал во главе заговора, названного впоследствии его именем. Однако заговорщиков опередили: 5 августа Джон и его брат Александр Рутвен были убиты в собственном доме охраной короля. В Шотландии тогда сомневались, а существовал ли заговор вообще, да и до сих пор историки не имеют однозначного ответа на этот вопрос. Описанные Яковом VI и его приближенными события могли быть просто выдуманным поводом к устранению опасного и популярного лидера крайних протестантов. После «чудесного спасения» король тут же конфисковал графский титул и владения Рутвенов; младшие братья убитых Патрик и Уильям Рутвены бежали в Англию.