Как поверенный по делам монастыря отец Исаия стал «правой рукой» настоятеля, преподобного Иннокентия, и не только хорошо ознакомился со всем монастырским хозяйством и многотрудными обязанностями аввы обители, но и находился под непосредственным духовным руководством святого отца. После кончины архимандрита Иннокентия братия Глинской пустыни избрала иеромонаха Исаию на должность настоятеля обители, в которой он подвизался почти четверть века — с 1888 до 1912 года, года его невинного страдания от злых людей и блаженной кончины.
В должности настоятеля отец Исаия много потрудился для благоустройства и процветания обители, как внешнего, так и внутреннего. Были построены новые храмы и дома, обновлена церковная утварь, устроена больница с домовой церковью. При нем в Глинской пустыни были организованы разнообразные мастерские, процветали садоводство, огородничество, пчеловодство и рыбоводство.
С ростом благосостояния Глинской пустыни возросла и её благотворительность. В годы настоятельства отца Исаии обитель ежегодно принимала около 50 тысяч богомольцев, которые бесплатно пользовались жильём, монастырской трапезой, лекарствами, одеждой, обувью, а иногда получали и денежную помощь. В случае нужды жители окрестных деревень безвозмездно получали от пустыни помощь хлебом или деньгами. В 1890 году при Глинской пустыни был создан «Дом трудолюбия» для обучения в нем разным ремёслам и грамоте крестьянских детей-сирот.
Заботясь о просвещении народа, отец Исаия организовал в 1891 году в Глинской пустыни издание религиозно-нравственных книг и листков. Большой популярностью пользовались «Глинские листки» и «Глинские Богородицкие книжки». Они содержали выдержки из житий и творений святых отцов и подвижников благочестия. Понимая, какое значение имеет духовное чтение в борьбе христианина со своими страстями, отец Исаия всеми мерами способствовал издательской деятельности своей обители. Уже в середине 1893 года пустынь издала 35 «Глинских листков» и 22 книги. Они бесплатно раздавались в благословение богомольцам. Обитель поставила также своей задачей издание жизнеописаний замечательных подвижников Глинской пустыни, и при отце Исаии было издано 15 таких жизнеописаний.
В 1908 году для борьбы с сектантскими лжеучениями в обители был открыт миссионерский кружок во имя святого апостола Иоанна Богослова. В обязанности членов кружка входило ежедневное чтение поучений в храмах, а также среди народа в гостиницах, столовых, на монастырских дворах. Эта деятельность велась под непосредственным руководством и наблюдением отца Исаии.
Но среди этих многогранных и благих внешних трудов основной заботой настоятеля было созидание правильной внутренней жизни братии, и здесь большое внимание он уделял бодрствованию каждого инока над своей душой. Сам отец Исаия, несмотря на множество забот, не только не терял внутренней собранности, но и преуспел в духовном трезвении, то есть в непрестанной молитве при постоянном внимании к своим помыслам и сердечным движениям.
Игумен Исаия говорил, что с трезвением соединено и составляет как бы единое целое немедленное отвержение приражающихся греховных помыслов. Поставив ум в трезвенное состояние, мы должны бдительно смотреть на нападающие помыслы и отвергать их при самом появлении, не принимая их и не давая им проникнуть в наше сердце. Отец Исаия говорил, что в борьбе с греховными помыслами в первую очередь требуется молитвенная деятельность ума, а иначе от помыслов избавиться мы не можем.
Игумен Исаия призывал иноков внимательно читать и изучать Божественное Писание, ибо Слово Божие помогает бороться с греховными помыслами. И самым главным в духовной жизни христианина он называл Причащение Святых Христовых Тайн, которое, соединяя нас с Богом, является одновременно и смыслом нашей жизни, и спасительным средством искоренения греховных помыслов. Во время настоятельства этого ревностного подвижника и пламенного молитвенника богослужения в Глинской пустыни совершались с особым благоговением и торжественностью.
Отец Исаия сам прошёл строгую школу полного послушания старцам и знал, что невозможно иноку научиться трезвению без частого откровения помыслов, поэтому при нём старчество особенно процветало в обители. При поступлении в Глинскую пустынь каждому назначался старец, которому ежедневно следовало открывать свои мысли и поступки, без благословения его ничего нельзя было предпринимать. Именно это делание возводило Глинских подвижников на высоту духовного совершенства, сохраняя преемственность древних иноческих традиций.