Следует вспомнить здесь и Макарьевские соборы — поместные соборы Русской церкви, созванные митрополитом Московским Макарием в 1547 и 1549 годах с целью канонизации русских святых. Почему? Потому что до сих пор бытует мнение, что именно тогда была канонизирована преподобная Евфросиния Московская. Однако тому нет никаких документальных подтверждений.
В эти времена мы получаем одни из первых изображений Вознесенской обители, в частности — собора Вознесения. Это сделали миниатюристы Лицевого летописного свода по заказу царя Ивана Грозного. Описывая и иллюстрируя историю, они не могли обойти тексты о появлении монастыря в Кремле. Однако за время собор менял свой внешний облик, а потому в Своде он изображался несколько раз — по-разному. То собор Вознесенского монастыря показан с одной главой (Голицынский том — Царственный летописец), то с тремя (Голицынский и Шумиловский тома), то даже с пятью (Остермановский второй том). Преобладают изображения трёхглавого храма. И понятно, ведь полноценный, пятиглавый возник тогда, когда Лицевой летописный свод уже был завершён. Поэтому даже странно, что попадается один раз рисунок собора как пятиглавого! Либо миниатюра была создана позднее. Увы, но иных особенностей собора тех времён в рисунках мы не замечаем.
Перестройка Вознесенского собора в 1521 году не была последней. По инициативе Бориса Годунова и по указу царя Фёдора Ивановича это сделали вновь в 1587—1588 годах. Оставили старый подклет с гробницами княгинь, великих княгинь и цариц, а на нём воздвигли храм — пятикупольный, трёхнефный, четырёхстолпный. По сведениям из Пискарёвского летописца: «Повелением царя и великого князя Феодора Ивановича всеа Руссии поставлен храм камен на Москве в Кремле-городе в Девичьем монастыре у Вознесения о пяти верхах, болши старово и монастыря прибавлено». Собор с тех пор стал чем-то напоминать другой кремлёвский — Архангельский.
С 1613 года до самой своей кончины в Вознесенском монастыре проживала мать царя Михаила Фёдоровича — великая старица Марфа. Именно она построила в обители храм во имя святого покровителя молодого царя — преподобного Михаила Малеина. В храме устроили придел во имя святого Феодора Стратилата — тезоименитого покровителя боярина Фёдора Никитича Романова (патриарха Филарета). Здесь находилась одна из святынь монастыря — на стене за престолом висел образ Богоматери Феодоровской, который был принесён делегацией бояр и священников, просивших в Костроме Михаила Романова принять Московское царство.
Именно бояре Романовы оказывали особое внимание Вознесенскому монастырю, так как были связаны с династией русских великих князей и царей по женской линии. По этой причине тогда стали особенно важны поклонение гробницам собора и заупокойные молитвы перед ними. В особые дни поминовения надгробия украшали драгоценными покровами. Тогда же продолжалась знаменитая традиция привносить ценные вклады в обитель, украшать иконы Вознесенского собора. Старица Марфа, например, в 1630-е годы привнесла в дворцовую церковь Рождества Богоматери иконы и шитую подвесную пелену с изображением Богоматери Феодоровской, которая сохранилась до наших дней. А в соборе монастыря как будто бы появился даже особый придел «у инокини Великой Старицы Марфы Ивановны», упоминаемый в 1626 году. Правда, о его судьбе позднее мало что известно.
В то же время в монастырь попала и ещё одна реликвия, дошедшая до нашего времени в сохранности. Это подвесная пелена «Богоматерь Одигитрия», сделанная из бархата и тафты, расшитая жемчугом. Она стала вкладом в 1630 году от княгини Орины Мстиславской, которая после кончины мужа — Фёдора Мстиславского, выдающегося государственного деятеля и полководца, — стала монахиней Вознесенской обители с именем Домника. Тогда она и привнесла пелену, которую вешали под чудотворной иконой Божией Матери «Одигитрия».
Не менее значимым стало приношение старицы Феодосии Сицкой, которая в 1662 году подарила монастырю серебряную водосвятную чашу. Поступали в обитель дары и от самих государей. Царь Михаил Фёдорович пожертвовал сюда покров с изображением Голгофского креста. От царя Алексея Михайловича сохранился потир из чистого золота. Известно, что цари в те времена приходили «для прощения» в Великую пятницу и в субботу в кремлёвский Вознесенский монастырь, чтобы «проститься у гробов».
Царский дом дружил с монастырскими сёстрами. Историк И. Забелин писал: «К столам цариц также приглашались и старицы монахини трёх московских девичьих монастырей: Вознесенского, Новодевичьего и Алексеевского. Эти старицы были тоже вдовы или дочери бояр, нередко очень родовитых, а главное родственницы царскому дому. Из каждого монастыря к столу всегда приглашались игуменья, казначея и соборные старицы, а сверх того, и избранные старицы, вероятно, свойственницы царскому дому. Всего за столом в один раз бывало до 12 стариц».