И вдруг в три часа утра раздался колокольный звон, которому принялись вторить все колокола Парижа. Началось то, что вошло в историю под названием Варфоломеевской ночи 24 августа 1572 года. Одновременно в окнах католиков, согласно распоряжению, загорелся свет, а улицы Сен-Жерменского квартала, в котором проживало много протестантов, наполнились вооруженными людьми с повязками на рукавах и белыми крестами на шляпах. Гиз со своими подручными уже был у особняка Колиньи. Швейцарцы, которых Генрих Наваррский предоставил в распоряжение адмирала, были слишком малочисленны, чтобы защитить его. Погромщики устремились вверх по лестнице. Один из них, ворвавшись в комнату Колиньи, спросил: «Ты адмирал?» Был получен утвердительный ответ, и вслед за тем пронзенное во многих местах тело полетело из окна, упав к ногам Гиза, который наклонился пониже, чтобы лучше разглядеть его, а затем со злостью пнул своего поверженного противника в живот. Налетевшая, точно стервятники, чернь в буквальном смысле слова разорвала тело Колиньи на куски, которые потом растащили по разным концам Парижа. Многих верных соратников потерял в ту ночь Генрих Наваррский, но само Провидение сохранило для него того, без кого он ничего не смог бы сделать, став королем Франции Генрихом IV: в самый разгар резни по парижским улицам двигался в направлении Лувра, где ему и дали убежище, юный отрок, облаченный в монашескую рясу, держа напоказ требник. Это был Максимильен де Рони — будущий герцог Сюлли, великий Сюлли.
Недолго пришлось поспать Маргарите. Ее разбудил оглушительный грохот. Из-за дверей, в которые барабанили руками и ногами, доносился крик: «Наварра! Наварра!» Служанка решила, что вернулся муж хозяйки, и открыла. В дверях показался окровавленный дворянин, за которым гнались четверо гвардейцев. Он обхватил Маргариту за талию, и оба упали на кровать. Появившийся капитан гвардейцев понимающе ухмыльнулся, решив, что королева Наваррская находится в объятиях любовника, и отчитал подчиненных за «бестактное поведение». Великодушно даровав жизнь ее «любовнику», он успокоил Маргариту относительно судьбы супруга, сообщив, что тот находится в безопасности. Когда гвардейцы удалились, спасенный галантно проводил свою спасительницу к ее сестре, герцогине Лотарингской. По пути они стали свидетелями того, как ударом алебарды был убит какой-то несчастный.
В ту роковую, кровавую ночь святого Варфоломея, с которой началась супружеская жизнь Генриха IV, Париж был залит кровью гугенотов. Карл IX, еще вчера друживший с ними и называвший их предводителя «отцом», внес свою лепту в эту кровавую бойню, хотя собственноручно, кажется, никого и не убил. По свидетельству Брантома, он из окна своей комнаты палил из аркебузы в сторону Сен-Жерменского предместья, где, как он знал, было много гугенотов, правда напрасно, поскольку его оружие не обладало необходимой дальнобойностью. Зато собственным примером и беспрестанными криками «Убивайте! Убивайте!» он подбивал на преступление других. Исключение было сделано лишь для немногих гугенотов, в том числе и для Амбруаза Паре, лучшего хирурга того времени, которого Карл спрятал в своей комнате.
Некоторые дворяне-гугеноты, остановившиеся в Сен-Жерменском предместье, узнав о начавшейся резне, не хотели верить, что распоряжение дал сам Карл IX, и вместо того чтобы бежать, решили отправиться в Лувр искать защиты у короля. Кое-кто из них даже подумал, что Гизы и их приспешники покушаются на королевскую особу, и попытался переправиться через Сену, стремясь прийти на помощь монарху. Однако на их пути встало около двух сотен солдат, открывших по ним огонь из аркебуз под одобрительные возгласы «Убей, убей!» — так что им пришлось спасаться бегством, кто как мог: на своих двоих, верхом, в сапогах или босыми, бросив всё, что имели, лишь бы унести голову на плечах. Карла IX при виде крови охватил охотничий азарт, как обычно с ним бывало на охоте, когда он не мог остановиться, убивая невинное зверье ради одного только удовольствия видеть, как хлещет кровь из подстреленной дичи. Некоторые отрицают его участие в кровавой бойне Варфоломеевской ночи, ссылаясь на то, какие угрызения совести он позднее испытывал, — но это было значительно позднее и под влиянием сразившей его болезни, воспринятой им как Божья кара. Правда, как сообщают очевидцы, Карл IX, услышав первые выстрелы, устрашился последствий собственного решения и послал нарочного к Гизу с требованием остановить кровопролитие, но, естественно, оказалось уже слишком поздно. Было ли это искренним порывом или игрой на публику, нам не дано знать.