В субботу, во второй половине дня, когда Карл IX послал узнать о самочувствии раненого, а Маргарита отправилась навестить его, Екатерина собрала своих советчиков в аллее парка Тюильри. Там составили список тех, кто должен умереть. На этот раз королева-мать действительно приняла решение о массовом убийстве, она боялась, что гугеноты подготовят переворот, а Карл IX и в самом деле будет преследовать виновников неудавшегося покушения на адмирала. Во время ужина она услышала, как гасконец Пардальян угрожал тем, кто осмелится чинить препятствия правосудию. Первой ее целью было уговорить короля и вырвать у него согласие. Рец поспешил вечером к королю, чтобы разоблачить протестантский заговор с целью этой же ночью захватить его мать, брата герцога Анжуйского и его советников. Он сказал, что королева-мать и его брат именно поэтому и дали согласие на покушение. Король был ошеломлен и долго противился уговорам убийц, потом — на грани нервного срыва — уступил. После его согласия предумышленная бойня приняла характер наказания группы мятежников, посягнувших на королевскую власть. Составили их список, обсудили несколько имен и по просьбе герцога Неверского вычеркнули Конде и Генриха Наваррского.
Поздно вечером в Лувр вызвали представителей городских властей и приказали им принять чрезвычайные меры, закрыть ворота и вооружить горожан. В качестве сигнала для начала бойни договорились использовать набат колокола церкви Сен-Жермен-л'Оксерруа.
Маргарита оставила захватывающий рассказ об этой ночи. Обе партии ей не доверяли и держали в неведении, но ее не покидало ощущение надвигающейся катастрофы. Во время вечерней аудиенции королева-мать, увидев, что она сидит на ларе рядом с сестрой, герцогиней Лотарингской, приказала ей идти спать. Герцогиня, которая была посвящена в тайну, обняла ее и взволнованно сказала: «Ради Бога, сестра, не ходите туда», но разгневанная Екатерина повторила свой приказ. Марго вышла из спальни матери, «похолодев от ужаса, не зная, чего я должна бояться». Ее муж покинул особняк адмирала, расставив во дворе своих гвардейцев. Потом после вечерней аудиенции короля он лег в постель.
Когда его жена вошла в спальню, она увидела, что брачное ложе «окружено примерно тридцатью гугенотскими дворянами, которых я не знала, так как была замужем совсем недавно». Они всю ночь говорили о несчастном случае с адмиралом, решив, что утром пойдут к королю требовать наказания для герцога Гиза, и если он не согласится, расправятся с Гизом сами. До их спальни не дошел шум побоища, и они ничего не знали о начавшейся резне. Генрих на рассвете отправился со своей свитой играть в мяч, а его жена наконец уснула.
Внезапно ее разбудил окровавленный человек, упавший на нее с криком: «Наварра, Наварра!» Это был Габриель де Леви, граф де Леран, за которым гнались королевские гвардейцы. Их капитан де Нансе из уважения к королеве Наваррской сохранил ему жизнь. Обезумевшая от ужаса, Маргарита сменила окровавленную сорочку, накинула халат и побежала к своей сестре, герцогине Лотарингской. В трех шагах от нее был убит алебардой какой-то несчастный. Первый дворянин ее мужа Миоссанс и его камердинер д'Арманьяк бросились к ее ногам, умоляя спасти им жизнь. Наконец ей удалось добраться до покоев короля, где она, упав на колени, стала молить его о милосердии.
Между тем Генрих и его спутники были задержаны во дворе Лувра и препровождены к королю вместе с принцем Конде. Стоявшая у дверей королевской опочивальни стража пропустила только принцев. «Прощайте, друзья мои; Бог знает, увидимся ли мы снова!» — сказали они. Остальных вытолкнули во двор вместе с теми, кто был застигнут в постели, и убили. «Можете себе представить, — воскликнет позже Генрих, — какое потрясение я испытал, видя, как убивают чуть ли не у изголовья моей кровати моих друзей и сподвижников».