Научное творчество П. оказало революционизирующее влияние на представления того времени о кровообращении и особенно о пищеварении, а его учение об условных рефлексах послужило фундаментом для последовательно материалистического подхода к изучению высших функций мозга животных и человека. Вслед за изучением хода нервов, ускоряющих работу сердца, П. исследовал регуляцию пищеварительной деятельности поджелудочной железы, предположив наличие в ней двойной иннервации. В 1876–78 установил, что между сосудами кожи и внутренних органов существуют антагонистические прессорно-депрессорные отношения, обеспечивающие поддержание в организме кровяного давления на постоянном уровне. В лаборатории при клинике Боткина П. сделал крупное открытие, положенное им в основу докторской диссертации: деятельность сердца регулируется четырьмя центробежными нервами – замедляющим и ускоряющим, ослабляющим и усиливающим. Затем П. перешёл к исследованию нервной регуляции пищеварения (продолжая тем самым свои ранние работы по секреторным нервам поджелудочной железы) и иннервации желёз желудка (опыты с мнимым кормлением, перерезкой пищевода и блуждающих нервов – эзофаго– и ваготомией). Выдающиеся успехи П. в этой области опираются как на разработку им основ хирургического (асептического) эксперимента, так и на творческое восприятие развиваемой Сеченовым и Боткиным идеи нервизма, утверждающей регуляторную роль нервной системы в осуществлении функций организма как в норме, так и при патологических состояниях. Опыты с созданием изолированного желудочка (называемого ныне павловским) позволили П. обнаружить две фазы желудочного сокоотделения: нервнорефлекторную (запальный, или аппетитный, сок) и гуморально-химическую. П. изучал также с помощью хронических фистул жёлчного пузыря физиологию печени, а на изолированной кишечной петле, полностью сохранявшей нормальную иннервацию, – механизм работы кишечника. Итогом этих исследований явились «Лекции о работе главных пищеварительных желёз» (1897).
Переход П. к изучению высшей нервной деятельности (ВНД) закономерен и обусловлен как общей направленностью исследований, так и его представлением о приспособительном характере деятельности пищеварительных желёз. Условный рефлекс, по П., – это наивысшая и наиболее молодая в эволюционном отношении форма приспособления организма к среде. Если безусловный рефлекс – сравнительно стабильная врождённая реакция организма, присущая всем представителям данного вида, то условный рефлекс – новоприобретение организма, результат накопления им индивидуального жизненного опыта. Основная заслуга П. в том, что, приступая к изучению ВНД, то есть психических реакций, он остался в роли последовательного и сознательного «чистого» физиолога, то есть материалиста, для которого душа и тело не составляют две раздельные сущности. Свою позицию П. блестяще изложил в речи «Экспериментальная: психология и психопатология на животных» (1903), а позднее развил в статье «Естествознание и мозг» (1910).