Еще больше, чем это самоуправство, чувствительного Грегора IХ возмутило вмешательство императора во внутриримскую партийную борьбу. Среди дворянских родов города у Фридриха было много сторонников, так что до 1238 года он фактически правил Римом. После триумфа при Кортенуова даже сложилось мнение, будто стремление к автономии дружественного Штауфену городского дворянства может быть согласовано с традиционными функциями Рима как идеального центра для Imperium Romanum, желанного места проведения выборов и резиденции Верховного Пастыря христианства. Для светских претензий Ватикана это означало бы первую угрозу.
Уже в августе 1238 года Грегор послал в Ломбардию заклятого врага Фридриха, прелата Грегора фон Монтелонго, чтобы укрепить враждебные императору города в их бунте. Этому искусному дипломату, который также обладал необычайными полководческими талантами, удалось вновь объединить ослабленные внутренней партийной борьбой города Лиги.
Следующей победой папской политики был союз старых соперников, Генуи (к тому времени там правил подеста родом из Милана) и Венеции (дож хотел отомстить за плененного при Кортенуова сына), объединившихся против общего сицилийского конкурента, чья торговая политика государственной монополии уже давно приносила убытки обоим морским городам. Теперь сицилийские порты должны были спешно готовиться к обороне.
Когда Фридрих в октябре 1238 года потерпел поражение в Брескии, Грегор IХ смог въехать в Рим победителем после того, как его союзникам удалось сдвинуть императорскую партию с ее властных позиций. Папская партия также завоевала первенство в коллегии кардиналов. Только тогда Папа решился на окончательный разрыв с горячо ненавидимым «врагом Святой Церкви», которого он совсем недавно заверил через главу францисканцев, что хочет быть с ним «unus et idem» («одним сердцем и одной душой»).
Дальнейшие переговоры были для него последней передышкой перед большим ударом: в Вербное воскресенье следующего года (20 марта 1239) Папа Грегор IХ во второй раз отлучил от церкви Штауфена, ничуть не удивившегося этому факту. Затем началась решающая фаза борьбы за Рим, сердце духовной и светской Imperium Romanum, которым Папа хотел управлять из Ватикана, а император с Капитолия. Только закат всего правящего рода Гогенштауфенов освободил Папу от суеверного страха, что благодаря «Антихристу» из этого дома оправдаются темные пророчества и секуляризованную католическую церковь может постигнуть ужасная кара.
Первым отзывом Фридриха на отлучение от церкви был моральное осуждение своего судьи. Торжественно восседая на троне, он приказал «своим устам», Петрусу фон Винеа, объявить горожанам Падуи, где его настигло известие об отлучении, что именно этот наместник Христа благодаря своим делам имеет меньше всего права возлагать проклятие на столь «мягкого, справедливого и щедрого императора». Такая аргументация должна была быть тем действенней, что отлучение основывалось на жалобах по поводу действий Фридриха в рамках сицилийской церкви. Оно было обосновано обвинением, что Штауфен якобы организовал в Риме заговор против Папы. Действительный повод, война против ломбардцев, вообще не был упомянут.
Понтифик же зашел в циркуляре от 21 мая 1239 года, в котором объявлялось об отлучении, так далеко, что назвал императора язычником. Так как содержание этого письма было предназначено для дальнейшей передачи в народ, необходимо представить себе, что вследствие недавно ужесточившихся законов о еретиках (дело рук самого императора) такое клеймо значило гораздо больше, чем само отлучение. Последнее же предполагало лишь высшее церковное наказание, что еще можно было поправить.
Вскоре после отлучения в ряды христиан, как огни пожара, полетели манифесты с картинами из откровения Иоанна (13,2). Папа начал: «И вышел из моря зверь, на головах его имена богохульные, с ногами, как у медведя, пастью, как пасть у разъяренного льва и телом барса. И отверз он уста свои для хулы на Бога... Взгляните на голову и тело этой бестии Фридриха, так называемого императора...» В качестве самого сильного оружия под конец Грегор использовал уже названное ранее утверждение, что Фридрих II является автором хулы о трех мошенниках, Христе, Моисее и Магомете, и якобы сказал, будто Христос был зачат и рожден, как любой другой человек. А также, по его мнению, никто не имеет право верить во что-либо, что не имеет разумного подтверждения.