В соответствии с этим актом Польское Королевство и Великое княжество Литовское объединялись в одно государство – Речь Посполитую . Единого государя предполагалось избирать на общем сейме, провозглашая его Королем Польским, Великим князем Литовским, Русским, Прусским, Мазовецким, Жемойтским, Киевским, Волынским, Подляшским и Инфлянтским. Отдельное избрание Великого князя Литовского прекращалось. Права поляков в княжестве и жителей княжества в Польше уравнивались. Для обсуждения общегосударственных дел предусматривались общие сеймы. Люблинская уния сильно ограничивала суверенитет княжества, но его государственности окончательно не ликвидировала. Оно сохранило свое войско, судебную систему, административный аппарат, печать с Погоней. Обе части Речи Посполитой имели самостоятельные названия и до конца XVII в. – государственные языки. В княжестве таковым был белорусский.
В результате Люблинской унии Польша получила большие возможности для проведения великодержавной политики в отношении населения Великого княжества. Политика Речи Посполитой по насаждению на белорусских землях католицизма и проведению полонизации дополнили дифференциацию белорусского общества этнорелигиозной дезинтеграцией. Полонизаторские процессы привели к отрыву от белорусской этнической общности ее интеллигенции, высших слоев, чем затруднили процесс формирования и развития единого народа. Противодействовать этим явлениям было трудно. Сенат Речи Посполитой состоял преимущественно из польских представителей. В сейме, где из ста восьмидесяти послов только сорок шесть приходилось на Великое княжество, из них на белорусские поветы – тридцать четыре.
Наряду с политическими ограничениями белорусская шляхта почувствовала и экономические ограничения. Она не могла получать земли в тех регионах, что были присоединены к Польше. Польская же шляхта стала активно пользоваться правом приобретения имений в княжестве. Все это явилось основой сепаратистских и даже антипольских настроений в Беларуси в 70 – 90 гг. XVI в. Было немало сторонников разрыва союза с Польшей, которые вели борьбу за независимость своего государства. В этот период регулярно созывало свои сеймы ВКЛ. В 1581 г. была создан высшая инстанция – Трибунал, а принятие в 1588 г. своего свода законов – Статута – по существу сводило на нет некоторые положения Люблинской унии.
В 1572 г. умер Сигизмунд II Август, последний Польский Король и Великий князь Литовский из династии Ягеллонов, занимавший трон по праву наследования. После него короли стали избираться сеймом, что часто приводило к так называемым бескоролевьям, которые тянулись от смерти одного монарха до избрания другого. После очередного бескоролевья на престол был избран Стефан Баторий (1576 – 1586 гг.). В 1579 г. войска Речи Посполитой под руководством Стефана Батория взяли Полоцк, Велиж, Усвяты и Великие Луки, в 1582 г. начали осаждать Псков, но занять его не удалось. В 1582 г. Ливонская война завершилась Ям-Запольским миром, по которому к Речи Посполитой перешла вся Ливония, Полоцк и Велиж.
В конце XVI – первой четверти XVII в. В правящих кругах Речи Посполитой была популярной идея присоединения к ней Московского княжества. Ее поддерживали и великокняжеские политики, рассчитывавшие, что в новом огромном евроазиатском государственном образовании княжеству будет принадлежать лидирующая роль. От дипломатических способов осуществления этой идеи – выдвижения на трон речи Посполитой кандидатуры Ивана IV и его сына Федора в 1573 и 1587 гг. – перешли к военным походам Лжедмитриев на восток в 1604 и 1607 гг. В военную компанию 1609 г. войско Речи Посполитой вернуло в состав княжества Смоленск, а в 1610 – 1612 гг. овладело самой Москвой, но было изгнано народным ополчением под руководством Д. Пожарского и К. Минина. В войне 1633 – 1634 гг. Россия попыталась взять реванш за Смоленск, но потерпела неудачу, и Полянский мир покинул границы прежними. Тем не менее, в конце XVI – первой половине XVII в. доминирующая роль в Восточной Европе перешла от Великого княжества Литовского, а затем Речи Посполитой, к их сопернику – Московскому государству.