К традиционным религиозным конфессиям ВКЛ XVI век добавил новые, появившиеся под влиянием Реформации. Реформация была широким социально-политическим и идеологическим движением в Европе, направленным прежде всего против римско-католической церкви и ее роли в политической системе общества. Идейными источниками Реформации стали новые духовные потребности общества эпохи Возрождения и кризис средневекового католицизма. Главное место в идеологии протестантизма занимало учение о том, что для спасения души верующего не требуется посредничество церкви, поэтому отрицалась ее необходимость (со всей иерархией во главе с папой римским). Единственным источником веры было объявлено Священное писание – Библия; отрицалось Священное предание (патристика, принятые на церковных соборах канонические акты, папские послания, декреты и др.). Идеологи Реформации требовали отмены многочисленных поборов в пользу католической церкви, пышного культа и культа святых мощей, а также секуляризации (отчуждения) церковного имущества в пользу государства и частных лиц, образования новой децентрализованной и «дешевой» церкви. Основными идеологами протестантизма были М. Лютер и Ж. Кальвин.
Реформация в Беларуси являлась частью европейской Реформации и пришла к нам в основном в виде кальвинизма. Социальной опорой реформационного движения выступили феодальная знать, часть средней и мелкой шляхты, зажиточные горожане. К протестантизму перешли такие магнатские роды, как Радзивиллы, Сапеги и др. Принадлежность к протестантской церкви позволяла принимать участие в политической жизни страны, влиять на принятие государственных решений, чего была лишена православная шляхта. Зачастую именно с этой целью часть знати ВКЛ принимала протестантизм, стремясь сохранить свое господствующее положение и после заключения Люблинской унии. В сенате от ВКЛ в 1569 г. заседали 15 протестантов, 2 католика, 5 православных; в 1580 г. – 13 протестантов, 6 католиков и 4 православных. Горожане и крестьянство боролись против угнетения светских и церковных феодалов, хотя широкого участия в борьбе не приняли. Формирование протестантских общин началось с середины XVI века, а к 1640 г. на территории ВКЛ было 140 протестантских сборов (общин). Первая кальвинистская община на Беларуси образована около 1563 г. в Бресте главным сторонником Реформации виленским воеводой Николаем Радзивиллом Черным (1515–1565).
В середине 1560-х гг. из кальвинизма выделилось радикальное течение – антитринитаризм (арианство). Антитринитарии – это сторонники религиозных учений и сект, отрицавшие один из основных догматов христианства о Троице – «триединство божье» (Бог-отец, Бог-сын, Бог-дух святой). Во второй половине XVI в. в Беларуси были основаны многочисленные общины антитринитариев (Лоск, Клецк, Любча, Ивье, Новогрудок и др.). Общины имели органы самоуправления, вели издательскую деятельность, созывали общие синоды. В догматическом плане они признавали Богом только «Бога-отца», а Иисуса считали простым человеком-проповедником. Белорусские антитринитарии добивались социальных и моральных изменений в условиях жизни людей. По мере развития реформационных процессов среди них выделились два направления: радикальное – за ликвидацию эксплуатации крестьянства, уничтожение феодальных привилегий, частной собственности (Якуб из Калиновки, Павел из Визны) – и умеренное – за ослабление феодального гнета, улучшение морального состояния общества, развитие просвещения (С. Будный и В. Тяпинский).
Во второй половине XVI в. в странах Европы началось религиозно-политическое движение против Реформации – контрреформация. Программу борьбы с реформационным движением Ватикан разработал на Тридентском соборе (1545–1563 гг.). Ватикан сделал ставку на появившийся благодаря усилиям испанского дворянина Игнатия Лойолы орден иезуитов и инквизицию. Был создан Индекс запрещенных книг (Index librorum prohibitorum) – издававшийся до 1966 г. Ватиканом официальный перечень книг, чтение которых католическая церковь запрещала верующим под угрозой отлучения. Сейм Речи Посполитой в 1668 г. отход от католичества приравнял к государственным преступлениям, за которые предусматривалась конфискация имущества и изгнание из страны, а с середины XVIII в. – смертная казнь. В связи с этим феодалы начали отходить от Реформации. Это привело к сокращению протестантских общин в ВКЛ (к 1696 г. здесь остался 51 протестантский сбор). Сама контрреформация в Великом княжестве Литовском не приобрела таких жестоких форм, как, например, Варфоломеевская ночь во Франции, когда с 23 на 24 августа 1582 г. было вырезано около 20 тыс. протестантов, или сожжение еретиков на кострах инквизиции. Не произошло в Беларуси и такого резкого сокращения протестантских общин, как в Польше. Этому способствовала более толерантная политика правящих кругов ВКЛ, где в отличие от Польши с ее моноконфессионализмом наблюдалась традиция сосуществования двух, а в XVII в. и трех христианских церквей со своими правами. К середине XVII в. антитринитаризм в Речи Посполитой был запрещен законодательно.