При Жигимонте III Вазе (1566–1632) иезуиты добились закрытия протестантских типографий и начальных школ. Процесс окатоличивания высших слоев, втянутых ранее в Реформацию, приобрел массовый характер. В 1770-х гг. на территории ВКЛ было около 90 иезуитских учреждений. Для подавления реформационного движения в ВКЛ иезуиты использовали свои коллегиумы, резиденции и миссии, которые вели проповедническую и образовательную деятельность. Большое значение придавалось благотворительной деятельности (организации приютов и госпиталей).
Реформация так активно воздействовала на религиозные процессы, что это привело к религиозному противостоянию, несмотря на то, что Гродненский сейм 1568 г. уравнял в правах всю шляхту христианской веры. Тем не менее с Реформацией связано дальнейшее развитие книгопечатания, литературы и искусства, что объяснялось подрывом сложившихся схоластических представлений о человеке и Вселенной и стремлением выйти из-под тотального контроля Ватикана.
Распространение Реформации и укрепление позиций католической церкви после Тридентского собора совпали с кризисными явлениями в православной церкви Речи Посполитой. Особенность положения православия в XVI в. состояла в том, что церковная жизнь регулировалась не только духовенством, но и светскими лицами: королем, отдельными светскими землевладельцами, горожанами. Фактически отношения патроната распространялись на все уровни церковной структуры: митрополии и епископии, патроном которых выступал сам монарх; монастыри и приходы, по отношению к которым патронат могли осуществлять частные лица, даже католики. Патронат под разу мевал право светского лица представлять своего кандидата на церковную должность, распоряжаться имуществом данного церковного учреждения, вмешиваться в церковную юрисдикцию, даже если это лицо имело низкий уровень собственно религиозной культуры. К тому же с конца 1580-х гг. обострился конфликт между православной иерархией Речи Посполитой и православными братствами. Последние отстаивали право мирян участвовать в управлении церковными делами, отстаивать интересы церкви перед инославной (от – иначе славить Бога) властью. Братства и наиболее активная часть православного духовенства стремились к переменам, к оздоровлению церковной жизни. В свою очередь православные иерархи, среди которых из-за нездоровых церковно-государственных взаимотношений оказались люди, не видевшие в православном вероучении главную ценность, жаждали прежде всего сохранения собственных привилегий. Они видели возможность решения конфликта с братствами и усиления своего влияния на прихожан в унии с католической церковью и переходе под юрисдикцию папы римского. Уния признавалась ими возможной при сохранении неприкосновенности традиций и прав Киевской митрополии и уравнении православного духовенства в статусе и привилегиях с римско-католическим.
Идею унии поддержали правящие круги Речи Посполитой. Они стремились с помощью унии укрепить государство и религиозно консолидировать общество, опасаясь, что созданный в 1589 г. Московский патриархат может стать выразителем интересов православия на белорусско-украинских землях Речи Посполитой. В условиях многочисленных войн между Московским государством и Речью Посполитой это осложняло положение православной церкви. Победа контрреформации, ослабление влияния православной церкви в ВКЛ, Ливонская война и политика царских властей на временно занятой территории Беларуси в отношении местной православной иерархии (полоцкий архиепископ был отправлен в ссылку), а также действия константинопольского патриарха Иеремии II во время его пребывания в польско-литовском государстве подтолкнули значительную часть православного клира к унии.
Подготовку унии возглавили православные епископы, рассматривавшие ее как равноправный союз двух церквей, а не как переход в иное вероисповедание. Сторонников унии (епископа владимирского и брестского И. Потея и епископа луцкого и острожского К. Терлецкого) поддержали митрополит киевский М. Рогоза и еще пять епископов, а также король Речи Посполитой, оказывавший давление на противников унии. Были разработаны условия заключения унии, содержащиеся в 33 артикулах. Православные епископы львовский Г. Балабан и перемышльский М. Копыстенский, часть шляхты, горожан, князь К. Острож ский выступили против унии. В Ватикане 23 декабря 1595 г. в присутствии папы римского Климента VIII и двух православных епископов ВКЛ была провозглашена церковная уния, однако на условиях Рима. Они состояли в том, что православная церковь Речи Посполитой организационно объединилась с католической церковью на условиях подчинения римскому папе и принятия католической догматики при сохранении православной обрядности и некоторых церковных традиций. Например, признавался католический догмат об исхождении Святого Духа не только от Бога-отца, но и от Бога-сына (филиокве), сохранялось право на богослужение на церковнославянском языке, на свою иерархию и прежнюю организационную структуру, приходское духовенство могло вступать в брак. Таким образом, киевская митрополия вышла из подчинения константинопольскому патриарху, но из Рима епископы-униаты привезли совсем не то, чего добивались первоначально и они сами, и пославшее их православное духовенство, и стоявшие за ним православные сторонники унии с Римом.