Развитие событий не благоприятствовало шотландским протестантам. Регентша попросила у Франции войска для подавления лордов Конгрегации, которые одержали над захватчиками несколько побед. Но из-за отсутствия денег их армия не могла долго продержаться на поле боя. Они неоднократно взывали к Англии, указывая, что если католикам удастся подавить протестантское восстание и королевство останется в руках католической партии, тесно связанной с Францией, то под угрозой окажется корона Елизаветы. Нокс, вернувшийся незадолго до этих событий, поддерживал протестантов проповедями и силой своей убежденности. Наконец, в начале 1560 года Елизавета решила послать в Шотландию войска. Английская армия присоединилась к шотландским протестантам, и казалось, что длительная война неизбежна. Но регентша умерла, и французы решили, что настало время приступить к мирным переговорам. В результате французы и англичане вывели свои войска.
Но как только непосредственная опасность миновала, между Ноксом и лордами, до сих пор поддерживавшими реформаторское движение, начались разногласия. В основе конфликта лежали экономические причины, хотя и не они одни. Лорды стремились завладеть церковными ценностями, а Нокс и его сторонники хотели использовать их, чтобы создать систему всеобщего образования, облегчить положение бедных и поддержать церковь.
В разгар этих неурядиц знать решила предложить Марии Стюарт вернуться в Шотландию и занять трон, унаследованный ею от отца. Мария надеялась быть шотландской королевой, оставаясь во Франции, но смерть мужа лишила ее таких надежд, и она приняла предложение шотландцев. В Шотландию она приехала в 1561 году. Она никогда не пользовалась популярностью, и поначалу следовала советам своего незаконнорожденного сводного брата Джеймса Стюарта, графа Меррея, одного из лидеров протестантов, удерживавшего ее от прямого столкновения с другими протестантскими лордами.
Нокс, по всей видимости, был убежден в неизбежности конфликта с королевой, и в этом вопросе она, судя по всему, разделяла его точку зрения. С самого начала она настояла, чтобы месса совершалась в ее личной часовне, и пламенный реформатор резко выступил против "идолопоклонства новой Иезавели". Между ними состоялось несколько бурных встреч. Но лорды, которым такое положение дел было на руку, не поддержали выпадов проповедника.
Осложнение отношений с королевой и некоторыми протестантскими лордами не помешало Ноксу и его последователям создать реформатскую церковь Шотландии, по своему устройству близкую к идеалам пресвитерианства, возникшего позднее. В каждой церкви старейшины и служители избирались, но последние занимали свои должности только после проверки, произведенной другими служителями. Столпами новой церкви стали "Книга церковной дисциплины", "Служебник церкви Шотландии" и "Шотландское исповедание".
В конечном счете Мария сама стала причиной своей гибели. Она всегда мечтала занять английский престол и, пытаясь осуществить эту мечту, потеряла сначала шотландский трон, а затем и жизнь. Дабы сделать свои претензии на английский престол неоспоримыми, она вышла замуж за своего двоюродного брата Генриха Стюарта, лорда Дарили, который тоже имел основания претендовать на него. Граф Меррей возражал против этого брака и против союза Марии с Испанией для искоренения протестантизма в стране, и когда его возражения проигнорировали, он восстал. Тогда Мария призвала на помощь лорда Босуэла, способного военачальника, разгромившего графа Меррея и вынудившего его искать защиту в Лондоне. Мария, воодушевленная этой победой, заявила, что скоро она взойдет на трон в Лондоне.
Лишившись здравых советов графа Меррея, Мария проводила все более неразумную политику. Она решила, что брак с Дарили был ошибкой, и дала понять это Босуэлу и другим. Вскоре после этого Дарнли был убит, и подозрения пали на Босуэла. Он был оправдан в ходе суда, на который не допустили ни одного свидетеля обвинения. Но оправдание не сняло с него подозрения, тем более что через несколько месяцев Мария стала его женой.
Шотландские лорды ненавидели Босуэла, и вскоре они восстали. Королева, предпринявшая попытку подавить восстание, лишилась поддержки войск и оказалась в руках лордов. Они убедили ее, что располагают доказательствами ее участия в убийстве Дарнли, и предложили ей либо отречься от престола, либо предстать перед судом за убийство. Она отреклась в пользу своего годовалого сына Якова VI, родившегося у нее от Дарнли, и граф Меррей вернулся из Англии, став регентом Шотландии. Марии удалось бежать и собрать войско. Но граф Меррей разгромил его, и ей оставалось только искать защиты у ненавистной Елизаветы в Англии.