Королева и архиепископ занялись реформированием монастырей. Они посещали самые крупные монашеские обители и те из них, которые особенно славились своей распущенностью, призывая всех вернуться к соблюдению монашеских обетов, порицая тех, кто не возрастал в благочестии, а порой сурово наказывая сопротивляющихся. В Рим пошли письма с протестами. Но папа, хотя он и не был реформатором, как политик понимал, что с королевой надо поддерживать дружеские отношения. В результате положение Изабеллы еще больше упрочилось, и даже самые коррумпированные среди прелатов королевства были вынуждены принять участие в реформе церкви.
Важную роль в реформаторской программе Изабеллы играли эрудиция Хименеса и особенно его глубокий интерес к Писанию. Изабелла была убеждена, что и церковь, и испанское королевство в целом нуждаются в образованных руководителях, и поэтому поощряла распространение просвещения. Она сама была человеком ученым и окружила себя множеством образованных мужчин и женщин. При поддержке Фердинанда она развивала книгопечатание, и вскоре типографии появились во всех крупных городах их королевств. В осуществлении всех этих проектов активное участие принимал Хименес. Но самыми значительными его начинаниями были основание университета в Алкале и публикация "Камплутской полиглоты". Выпускниками Алкальского университета, расположенного в нескольких милях от Мадрида, вскоре стали многие выдающиеся представители испанской религиозной и литературной жизни, в том числе Сервантес и Лойола. "Камплутская полиглота" (от латинского названия города Алкалы – Камплут) представляла собой большое издание Библии на нескольких языках, подготовленное лучшими из местных ученых: трое обращенных из иудаизма готовили древнееврейский текст, критянин и два испанца отвечали за греческий текст, лучшие латинисты Испании работали над текстом Вульгаты. Текст, располагавшийся в параллельных колонках, вышел в шести томах (четыре первых – Ветхий Завет, пятый – Новый Завет и шестой – развернутое исследование древнееврейской, халдейской и греческой грамматик). Работа была закончена в 1517 году, но опубликовали это издание только в 1520 году. Рассказывают, как радовался Хименес "этому изданию Библии, раскрывающему в столь трудные времена священные источники нашей религии, из которых изольется богословие куда более чистое, нежели то, которое исходит из менее прямых источников". Заяви он так открыто о превосходстве Писания над преданием несколько лет спустя, его бы обвинили в "лютеранской ереси".
Университет в Алкале, основанный кардиналом Франсиско Хименесом де Киснеросом, скоро стал центром Реформации.
Однако интерес Хименеса и Изабеллы к научным изысканиям отнюдь не побуждал их к большей терпимости. Исследования поощрялись, если они способствовали оздоровлению обычаев и исправлению нравственных норм. Но любые отклонения в вероучительных вопросах строго наказывались. Инквизиция, находившаяся официально в руках папы и использовавшаяся в основном как инструмент папской политики, была передана папой в ведение Фердинанда и Изабеллы. Главой инквизиции в Кастилии был назначен доминиканский монах Томас Торквемада, известный своей бескомпромиссностью, ярый сторонник ортодоксии, и его имя получило широкую известность благодаря рвению, с которым он преследовал тех, кого считал еретиками. Ими были в основном принудительно обращенные евреи, которых теперь обвиняли в "иудействовании".
Во время правления Изабеллы при твердой поддержке Хименеса давление на иудеев и на "иудействующих" христиан усиливалось. Наконец, в 1492 году был издан указ, согласно которому все евреи должны были либо принять крещение, либо покинуть территории, принадлежавшие Изабелле и Фердинанду. Большинство из них креститься отказались, хотя это означало изгнание и потерю большей части имущества. Точные цифры неизвестны, но, по всей видимости, в изгнание было отправлено около 200 000 испанцев иудейской веры, что для многих из них обернулось смертью, захватом в плен пиратами и другими бедствиями.
Незадолго до обнародования королевского указа, направленного против евреев, кастильские войска захватили Гранаду. Это был последний оплот мавров на полуострове, и по условиям капитуляции мусульманам предоставлялась свобода исповедовать свою религию. Но вскоре Хименес и его представители попытались насильственно обращать мавров, и у тех не осталось другого выхода, кроме как поднять восстание. Оно было потоплено в крови. Но сопротивление продолжалось, и в конце концов был принят указ, предоставлявший маврам выбор между крещением и высылкой. Когда стало ясно, что ожидается массовый исход, был издан новый указ, запрещавший маврам покидать страну и обязывавший их креститься. Мавров обращали насильственно, а инквизиция сбилась с ног, выслеживая тех, кто не отказывался от своих мусульманских обычаев. Хименес, назначенный великим инквизитором, принял выполнение этой задачи близко к сердцу. В 1516 году после смерти Фердинанда и Изабеллы он стал также регентом и пытался использовать свою власть для принуждения "обращенных" мавров отказаться от их традиционной одежды и исконных привычек. Но в этом он потерпел неудачу, и в королевстве опять вспыхнуло восстание и пролилась кровь.