Война в Италии. Непосредственные результаты антифранцузской политики сказались сразу. Договор в Барселоне (1493 г.), путем заключения которого Карл VIII хотел обеспечить нейтралитет арагонской короны в итальянских делах, не оправдал его надежд. Карл VIII, будучи потомком королей анжуйской династии, желал предъявить претензии на неаполитанскую территорию, которой тогда владел незаконный отпрыск Альфонса V, дядя Фердинанда. Фердинанд не мог допустить, чтобы французы завладели Неаполем. Он при этом руководствовался не только династическими соображениями. Традиционная политика Арагона, целью которой являлась экспансия в Средиземноморском бассейне, требовала овладения Неаполем как плацдармом для новых захватов в Италии. Кроме того, Фердинанд стремился воспрепятствовать территориальному расширению Франции. Между тем Карл VIII предпринял поход на Неаполь, причем, вступая в Италию, он полагал, что Неаполь, будучи леком папы, исключен из сферы действия барселонского договора. Разразилась война, и Фердинанд немедленно заключил союз с папой, Венецией, императором Германии и герцогом Миланским. И хотя вначале Карл VIII добился успеха, но вскоре восстание в Неаполе и угроза со стороны Руссильона заставили французского короля подписать соглашение о прекращении военных действий (1497 г.). За этим соглашением последовало другое, секретное, по которому Фердинанд, изменив курс, договорился с Францией о разделе неаполитанского королевства, причем за Арагоном оставалась Калабрия в качестве возмещения за военные издержки. После возобновления этого соглашения с Людовиком XII, преемником Карла VIII (11 ноября 1500 г.), планы захвата итальянских территорий начали осуществлять обе державы. Но немедленно произошел разрыв, так как Людовик XII потребовал себе одну область, на которую претендовал Фердинанд. Снова открылись военные действия (1502 г.); сперва ход военных действий был неблагоприятным для испанцев, которыми командовал Гонсало де Кордова, тогда уже известный своими победами в войне с Гранадой. Фердинанд и Изабелла (которая сперва была вовлечена в неаполитанские дела против воли, поскольку планы её супруга были чужды интересам Кастилии, а затем принялась с энтузиазмом за их осуществление, желая таким образом укрепить политический престиж Испании) предоставили своему зятю Филиппу полномочия для ведения мирных переговоров с Людовиком XII. Одним из условий проектируемого соглашения было заключение брака между французской принцессой Клавдией и Карлом, первенцем Филиппа и Хуаны. Но в то же время испанские войска в Италии, получившие подкрепление, отомстили за прежние поражения, и Гонсало де Кордова одержал победы над французами при Семинаре, Чериньоле и Гареллано, захватив все неаполитанское королевство. Фернандо использовал этот успех и прекратил начавшиеся переговоры. Король Франции испросил перемирие, которое и было заключено 31 марта 1504 г. на трехлетний срок. Неаполь остался за Испанией, а война с Францией не возобновлялась еще в течение семи лет.
Новое разделение Арагона и Кастилии. 24 ноября 1504 г. Изабелла умерла в замке Мота, в Медине дель Кампо. В завещании она назначила наследницей свою дочь Хуану (Хуана и Екатерина были единственными оставшимися в живых отпрысками «католических королей»), отметив, что, в случае если она окажется неспособной принять бразды правления, регентом должен будет стать Фердинанд, до того времени как первенцу Хуаны исполнится двадцать лет. Личная уния Арагона и Кастилии сохранилась; но честолюбие Филиппа Красивого вскоре нарушило все расчеты Фердинанда и Изабеллы. Филипп пожелал управлять Кастилией.
Еще в сентябре 1504 г. он заключил союз с Людовиком XII, по которому было подтверждено прежнее соглашение о браке принцессы Клавдии с принцем Карлом, которому передавалось неаполитанское королевство. В то же время Филипп пытался привлечь на свою сторону Гонсало де Кордову и других испанских военачальников. Поэтому Фердинанд не решился открыто воспротивиться притязаниям своего зятя и на время отстранил его от регентства в Кастилии. Но он тотчас же совершил ловкий дипломатический ход и подписал с Людовиком XII (12 октября 1505 г.) договор, по которому все права на неаполитанское королевство французский король передавал своей племяннице Жермене де Фуа. Фердинанд должен был вступить с ней в брак, а Людовик XII обязался не претендовать на неаполитанскую корону, которую должны были унаследовать дети Фердинанда, и Жермены. Известие об этом договоре побудило Филиппа предпринять шаги к примирению с тестем, и он решил договориться с ним о разделе регентских прав на Кастилию. Но планы эти не удалось осуществить и не только потому, что они были несовместимы с честолюбивыми стремлениями эрцгерцога; проект Филиппа встретил сопротивление со стороны кастильской знати, враждебной Фердинанду. В результате было заключено компромиссное соглашение, по которому за Филиппом осталось регентство, а Фердинанд сохранял пост магистра духовно-рыцарских орденов Кастилии и право на получение половины доходов с Гранадского королевства. Обманутый в своих надеждах, Фердинанд удалился в «арагонские владения, причем, как сообщает один историк XVI в., он совершил по пути в некоторых городах поступки весьма недостойные и подлые, а посему другие города закрыли перед ним ворота и не пожелали его принять».