Среди донских казаков была сильная прослойка населении татарского происхождения. Во время княжении Василия III среди их атаманов были известны многие с монголо-татарскими именами. По сведениям историка С. Соловьева, число атаманов с татарскими именами в большем количестве было среди верховых казаков. Прослойка татарского населения среди казаков была остатком правящего татарского слоя, сохранившегося со времени их господства. Со времени распада Золотой Орды и перехода казаков в положение независимого быта, монголы теряли свое значение, растворялись среди казаков и сливались с ними. Ко времени начала царствования Иоанна Васильевича во главе донских казаков, как верховых, так и низовых, становятся известными атаманы исключительно с русскими именами, как, например: Федоров, Заболотский, Янов, Черкашин, Ермак Тимофеевич и другие.
Расселение донских казаков по условиям того времени, ограничивалось районами, наиболее пригодными для защиты против постоянной угрозы нападений от окружавших их азиатских орд. Население располагалось в укрепленных городках, обнесенных валами, с расставленными пушками, и представлявшими укрепленный лагерь.
С начала XVI века были известны городки верховых казаков, расположенные по Иловле, Медведице и Хопру, существовавшие бесспорно еще со времени Батыя, и не прекращавшие свое существование в течение всего времени господства Золотой Орды. Низовое казачество сосредоточилось в районе слияния Северного Донца и Дона, имея несколько городков, центром среди которых были Нижние Раздоры на Дону. Значительная часть донских казаков располагалась на среднем течении Северного Донца, в числе городков которых были известны Гундоры, Лугань, Митякин и др. Часть этик казаков состояла из остатков служащих обширной сети ямщицких линий распавшейся Золотой Орды, располагавшихся на главной линии, шедшей из центра ее, Сарая, в западном направлении и обратно. Казачьи городки, известные с XVI века были многочисленными и продолжали увеличиваться. В 1549 году ногайский мурза жаловался московскому князю, что донские казаки, подвластные Москве, в трех-четырех местах построили новые городки, грабят его людей, а многих убивают. Городки эти построены были бесспорно на пути, служившем одним из трактов для набегов татар, превращавшегося теперь в поселение казаков, закрывшего свободное движение. Москва, Литва и Польша, будучи бессильными защищать границы своих владений от нападений крымцев и других кочевников, старались обеспечить безопасность договорами с Турцией и ежегодной уплатой дани крымским ханам. Казаки служили их авангардом в борьбе с общими врагами, но не встречали не только их поддержки, а часто встречали противодействие и получали строгие требовании жить в мирных отношениях с ними и не нападать на Крым и владении Турции. Каждая страна старалась использовать казаков в своих целях, не считаясь с местными условиями казаков. Вмешательство во внутренние дела казаков приводили к тяжелым раздорам и резкому противодействию этим требованиям. Нередко со стороны турецких султанов, предъявлялись требования к крымским ханам, чтобы они не делали набегов на земли московского царя, на что следовали ответы ханов: «Если перестану делать набеги на валахов Польшу, Литву и московские владении, то чем же будут жить мои люди?» Война с отжившим миром кочевников была неизбежной. Гребенские казаки вели войны против ногайцев и черкесов, яицкие — против-ногайцев и киргизов, нападали на Сарайчик, превратившийся в центр Большой ногайской орды после распада Золотой Орды. Войны казаками против азиатского мира велись повсюду.
Одной из прочных связей донских казаков, как гребенских, так и яицких, с московским княжеством была церковная. Казаки в церковной иерархии входили в состав епархии епископа, переселившегося из центра Золотой Орды, Сарая, в московские пределы и находился под властью митрополита Всея Руси. От епископа, получившего название Крутицкого, казаки получали церковные книги, утварь, а иногда и назначаемое им духовенство. Зависимое положение в церковном отношении не ограничивалось только церковными вопросами и распространялось на связи военные, материальные и общекультурные. Па протяжении следующих; веков казаки находились в постоянной переписке с Москвой и эволюция русского языка московских; и донских писцов шла совершенно одинаково. Материальный вопрос в виде жалованья хлебом, сукнами и деньгами также был в сношениях казаков и Москвы одним из важных предлогов, как и вопрос военного снабжения и вооружения. Эта связь невольно ставила донских казаков в зависимость от Москвы, и в представлении Крыма и Турции они почитались за подданных московских царей, а днепровских — за подданных польско-литовских королей. Ответственность за деятельность казаков относили на ответственность Москвы, Литвы и Польши, на что получали ответ из Москвы и польско-литовских королей, кто казаки им не подвластны и действуют от них независимо. Этот дипломатический язык показывал на бессилие Москвы и польско-литовского королевства в борьбе против Крыма и Турции, боязнь нападения на их владения и, как следствие, на нарушение мирных отношений казаками. Казаки, несмотря на отсутствие военной помощи со стороны Москвы, Литвы и Польши, и даже их противодействия, имели достаточно сил и средств для отражения нападений алчных до грабежей и легкой нажиовы своих соседей, остатков отжившего кочевого мира. Считая лучшей обороной — наступление, казаки предпочитали наступательные действия, и нападали не только на Крым и ближайшие турецкие владении, но нередко на утлых суднах-душегубках переплывали Черное море и нападали на турецкие владении южного побережья, доходя до Константинополя. Походы в Турцию совершались отрядами донских и днепровских казаков самостоятельно или же соединенными силами. Истории казаков XVI и XVII веков показывает, что войска их не похожи были по своим военным качествам, по количеству и организации на группы беглых людей московских княжеств, превратившихся в воинственные казачьи войска с налаженным бытовым укладом, с населенными городками, хорошо оборудованными для обороны и хорошо налаженным внутренним управлением. Всесторонняя слабость и бессилие русского народа XVI века не может объясняться разбросанностью его в лесной болотистой глуши, неспособностью к общественной организации, а его тяжелым прошлым, в котором он находился триста лет, утеряв возможность нормального развитии, и теперь принимался за восстановление и заполнял потерянное прошлое. Казаки составляли часть его в прошлом, и так же, как и весь русский народ, в течение трехсот лет находились под иноземной властью и с начала XVI века начинали устраивать свою жизнь по собственному разуму, но на опыте, приобретенном ими в условиях прошлого быта и установившихся обычаев.