Параллельно с собиранием исконно русских земель вокруг Москвы к Русскому государству присоединяются новые земли. В 1472 году великий князь Иван III Васильевич (1440–1505) вступает в брак с греческой царевной Софией Палеолог, что в глазах русских людей придает ему дополнительную легитимность в качестве православного самодержца, наследника византийских императоров. В начале XVI века разрабатывается теория Москвы — «третьего Рима», сформулированная, в частности, старцем псковского Спасо-Елеазарова монастыря иноком Филофеем: «Первый Рим пал от нечестия, второй (Константинополь) от засилия агарянского, третий Рим — Москва, а четвертому не бывать». Параллельно с укреплением власти великого князя Московского возрастает и значение Московского митрополита.
Начало XVI века ознаменовано спорами между «стяжателями» и «нестяжателями» — сторонниками и противниками монастырского землевладения. К этому времени на Руси существовало множество монастырей, которые подразделялись на общежительные и особножительные. В общежительных монастырях акцент делался на послушание, телесный подвиг, соборную молитву, благотворительность; в особножительных — на «умное делание» и удаление от мира. Уставы тех и других монастырей предписывали нестяжание, однако и общежительные, и особножительные монастыри могли иметь во владении земли, села, крестьян и получать доходы, которые распределялись между братией. Собственниками земли были также епархии и приходы. Монастырское и церковное землевладение нередко вызывало недовольство государственной власти, в результате чего периодически имели место попытки конфискации церковных земель. Одна такая попытка произошла при великом князе Иване III, который выступил с инициативой отторжения земель у митрополита, епископов и монастырей с одновременным переводом епископата и монастырей на казенное обеспечение. Эта инициатива князя вызвала в Церкви бурную и в целом негативную реакцию. В 1503 году в Москве был созван церковный Собор, который поддержал идею церковного землевладения в противовес инициативе великого князя.
Главным идеологом церковного землевладения в начале XVI века был преподобный Иосиф Волоцкий (1439/40–1515), который считал, что владение землей и недвижимостью обеспечивает Церкви независимость от светской власти и открывает возможность благотворительной деятельности. Основанный им под Волоколамском монастырь являл пример широкой благотворительности: в год неурожая монастырь ежедневно кормил до 700 человек, в том числе 50 детей-сирот. Иосиф Волоцкий был одним из выдающихся просветителей и борцом с ересью жидовствующих — рационалистическим движением, возникшим в Новгороде в конце XV века. Под влиянием иудаизма и, возможно, зарождавшегося в Европе религиозного реформизма жидовствующие выступали с критикой основополагающих христианских догматов — о Святой Троице, об Иисусе Христе как Боге и Спасителе, об иконопочитании. Родоначальником ереси, по свидетельству Иосифа, был некий еврей Схария, который совратил в нее новгородских священников Дионисия и Алексия. Из Новгорода еретическое движение быстро перешло в Москву, где его адептами стали некоторые высокопоставленные лица, в том числе посольские дьяки Федор и Иван Курицыны, а священники Дионисий и Алексий были переведены из Новгорода и назначены протопопами кремлевских соборов. Против этой ереси Иосиф написал свое знаменитое сочинение «Просветитель», в котором собрал свидетельства из сочинений отцов Церкви в защиту православных догматов.
В борьбе с жидовствующими преподобный Иосиф объединил свои усилия со святителем Геннадием Новгородским, другим выдающимся просветителем, впервые собравшим все книги Священного Писания в единый свод и в 1499 году издавшим в рукописном виде так называемую «Геннадиевскую Библию». Собирание свидетельств от Писания и церковного Предания было неотъемлемой частью программы по искоренению ереси.
Однако у этой программы была и другая составляющая — требование наказаний и даже смертной казни для отступников от Православия. Выдвигая это требование, Иосиф Волоцкий апеллировал к византийской истории.
В 1504 году в Москве в присутствии великого князя Ивана III и его сына Василия состоялся Собор, приговоривший к смертной казни еретиков, против которых боролись Геннадий Новгородский и Иосиф Волоцкий. Начались казни, подобных которым на Руси доселе не видели. 27 декабря того же года в Москве были заживо сожжены в клетках Иван Курицын и его сподвижники, в Новгороде сожгли Юрьевского архимандрита Кассиана и других еретиков, многих адептов ереси посадили в тюрьмы или отправили на покаяние в монастыри.