Будучи одним из выдающихся церковных просветителей, митрополит Макарий предпринял грандиозный труд по собиранию всей духовной литературы, «чтомой» на Руси. Эту работу он начал еще будучи архиепископом Новгородским (1526–1542) и продолжил в Москве. «Великие Минеи Четьи» митрополита Макария представляют собой свод житий святых, проповедей, богословских и исторических трактатов, как переведенных с греческого и латыни, так и оригинальных. С именем Макария связано и начало книгопечатания: первые книги, напечатанные Иваном Федоровым в 1564–1565 годах, — Апостол и Часослов — были изданы по благословению митрополита Макария, хотя увидели свет уже после его кончины.
Ранние годы правления Ивана Грозного были ознаменованы рядом крупных военно-политических успехов: в 1552 году была взята Казань, в 1556-м — Астрахань, в 1563-м — Полоцк. Народ сплотился вокруг царя, в котором видели искреннего защитника православной веры и гаранта государственной целостности. Однако вскоре после смерти митрополита Макария в деятельности царя наступил резкий перелом, вызванный, помимо всего прочего, его повышенной подозрительностью и страхом перед заговором. В конце 1564 года царь покинул Москву и поселился в Александровской слободе, где создал некое подобие монастыря во главе с самим собой, а в начале 1565 года учредил опричнину — карательную организацию, подвластную только ему и неподсудную общественным органам власти. Страна была разделена на опричнину, в которую входили царские бояре, и земщину, которую составляли прочие бояре со своими дворами. В задачу опричников, набиравшихся из молодых бояр и дававших клятву на верность царю, входило выявление любых возможных политических заговоров и уничтожение заговорщиков. Начались казни, многие бояре и их семьи были заподозрены в измене и сосланы в разные города. Имущество казненных и сосланных переходило в руки царя и опричников. Внешним отличием опричников служили собачья голова и метла, прикрепленные к седлу и означающие, что они грызут и метут изменников.
Самодурство и жестокость Грозного царя стали причиной нестроений в Церкви. После митрополита Макария в 1564 году на митрополичий престол был избран духовник царя Афанасий, однако по неизвестным причинам спустя два года он оставил митрополию и удалился в монастырь. Святитель Казанский Гурий, избранный на митрополию в 1566 году, был введен на митрополичий двор, однако спустя два дня изгнан оттуда. Наконец, по воле царя митрополитом был избран Соловецкий игумен Филипп, из боярского рода Колычевых, посаженный на митрополичий престол в июне 1566 года. Сначала наедине с царем, а потом и публично святитель Филипп начал высказывать свое несогласие с разделением страны на опричнину и земщину, протестовать против жестокостей самодержца.
В марте 1569 года, в Крестопоклонную неделю, когда царь с опричниками вошли в Успенский собор, митрополит, стоявший на своем месте, отказался дать благословение царю и обратился к нему с обличительной речью: «Сколько страждут православные! У татар и язычников есть закон и правда, а у нас нет их; всюду находим милосердие, а на Руси и к невинным нет жалости». Это привело Грозного государя в бешенство, и он распорядился о начале судебного преследования святителя. Осенью 1569 года, во время совершения святителем литургии, в Успенский собор вошла группа опричников. Богослужение было прервано, зачитали обвинительный приговор, со святителя сорвали облачение и на дровнях вывезли из Кремля. Святитель был заточен в Тверской Отрочь монастырь (в прошлом место ссылки преподобного Максима Грека), а род Колычевых был подвергнут пыткам и казням. Отрубив голову племяннику святителя, Грозный отправил ее митрополиту со словами: «Вот голова твоего сродника, не помогли ему твои чары». В декабре 1569 года святитель был задушен опричником Малютой Скуратовым по личному распоряжению Грозного.
Грозного царя сменил на русском престоле Федор Иоаннович (1557–1598), отличавшийся слабостью здоровья, кротостью и набожностью. В его правление произошло историческое для Русской Церкви событие — учреждение патриаршества. В отличие от автокефалии, которая была провозглашена без согласия Константинопольского патриарха, Московское патриаршество учреждалось с соблюдением всех необходимых канонических условий. В 1586 году Москву посетил Антиохийский патриарх Иоаким V, а в 1588-м — Константинопольский патриарх Иеремия II. Оба иерарха приезжали в Москву за милостыней, которую получили из щедрых рук царя. Иеремии II было в Москве сделано предложение перенести Константинопольский патриарший престол во Владимир, однако от этого предложения он отказался, справедливо полагая, что патриарший престол должен находиться там же, где и царский. Тогда к патриарху обратились с предложением «поставить на патриаршество Владимирское и Московское» митрополита Московского Иова. Патриарх сначала не соглашался, ссылаясь на отсутствие достаточных полномочий, но затем дал свое согласие.