В эпоху этой полемики Иосифу пришлось не только писанием, но и самим делом отстаивать неприкосновенность монастырского имущества.
Иосифов монастырь, как известно, находился в уделе Волоцком; когда умер благодетель монастыря князь Борис Васильевич, удел его разделился между двумя сыновьями: младший (Иван Борисович Русский) умер еще при Иване III и отказал свою часть великому князю Московскому; оставался в живых старший, Федор Борисович, которому принадлежал самый Волок-Ламский. Этот князь Федор любил разгульную жизнь и, нуждаясь в деньгах, захотел воспользоваться казной находившихся в его земле монастырей. Между прочим, он брал из Иосифова монастыря разные вещи, взял значительную сумму денег под видом займа и вообще начал его притеснять. Выведенный тем из терпения, суровый игумен решился наконец на открытую борьбу. Он послал одного из старейших иноков требовать возврата занятой суммы; князь грозил бить кнутом посланного. Однажды Федор Борисович пред своим приездом в монастырь прислал сказать игумену, чтобы готовил пир и «держал бы про него меды, а квасов бы не держал». Игумен ответил, что устав запрещает иметь хмельные напитки в монастыре. Иосиф купил жемчуг на ризы и епитрахиль; князь прислал просить этот жемчуг себе на венец к шлему и получил отказ. Тогда князь погрозил разорить монастырь, чернецов казнить кнутом. Иосиф начал советоваться с братией, что предпринять, и, желая испытать ее, предлагал разойтись по другим монастырям. Но братия подняла ропот; многие иноки, вступив в монастырь, сделали значительные вклады, надеясь спокойно провести в нем остаток жизни, а теперь нищими должны были скитаться по чужим обителям. Решили отправить в Москву челобитье великому князю и митрополиту, чтобы заступились за монастырь и приняли бы его в Московскую державу. Иосиф, конечно, заранее рассчитывал на благоприятный ответ и не ошибся. Мелкий удельный князь не посмел противиться государевой воле; зато он постарался возбудить против волоцкого игумена гнев местного церковного владыки.
Волоцкой удел принадлежал к Новгородской епархии. Архиепископом в Новгороде был тогда преемник Геннадия Серапион, бывший игумен Троице-Сергиевой лавры. Иосиф обратился с челобитьем в Москву, не предупредив о том своего владыку, и, так сказать, самовольно исключил монастырь из его епархии, не взяв владычного благословения. Он отговаривался после тем, что посланный им чернец не был пропущен за новгородский рубеж заставой, которая была временно учреждена по случаю свирепствовавшей в той земле моровой язвы (мор железою). Однако Серапион, напрасно прождав еще около двух лет какого-либо отзыва со стороны Иосифа, отважился на решительный шаг: он послал игумену неблагословенную грамоту, отлучающую его от священства и св. причастия. Такой поступок повлек за собой важные последствия. По жалобе Иосифа Серапион неволей привезен в Москву и предан суду духовного собора. Председателем на соборе был покровитель Иосифа, митрополит Симон, а вторым после митрополита лицом тут заседал младший брат волоцкого игумена, Вассиан, незадолго возведенный в сан архиепископа Ростовского. Серапиона обвинили в неуважении к митрополиту и великому князю. В особую вину поставили ему следующее выражение его неблагословенной грамоты Иосифу: «Что еси отказался от своего государя в великое государство… ино еси отступился от небесного, а пришел к земному». Конечно, это было написано в том смысле, что игумен променял Царство Небесное на земные блага, а его истолковали таким образом, что небесным тут назван князь Федор, а земным сам великий князь. На соборе Серапион утверждал, что он был прав, и давал иногда резкие ответы. Так, на вопрос своего явного неприятеля Вассиана, архиепископа Ростовского, на основании каких священных правил он отлучил и не благословил Иосифа, Серапион с запальчивостью отвечал: «Волен я в своем чернеце, а князь Федор волен в своем монастыре, хочет — жалует, хочет — грабит». По соборному определению, Иосиф был разрешен от владычнего запрещения и ему послано благословение священнодействовать. А Серапион лишен святительского сана и заключен в монастырь (сначала Андроников, потом Троице-Сергиев). Но дело тем не кончилось.