Однако московско-тверской конфликт приобретал все более острый характер. Из-за вмешательства церкви вопрос о том, кому достанется светская власть, получил общерусское звучание.
Дело осложнилось тем, что сама Русская православная церковь — единственная сила, которая обеспечивала в удельный период сплоченность русских земель, — со второй четверти XIV в. оказалась разделенной. Прежде митрополиты для Руси избирались исключительно из греков и поставлялись (получали сан) в Греции. Теперь их разрешалось избирать не только в Греции, но и на Руси, а также в Литве. Первоначально единая Русская церковь в конце XII — начале XIV в. стала организационно распадаться. Живший во Владимире митрополит продолжал именоваться Киевским и всея Руси. Митрополиты, управлявшие отделившимися западнорусскими епархиями, жили то в Киеве, то в Галиче, то в Вильно. В 1305 г. после кончины митрополитов галицкого и владимирского появилась возможность объединить русские митрополии.
На престол митрополита всея Руси претендовали Геронтий и Петр (ставленники соответственно Михаила Тверского и Юрия Галицкого). Тверские священники обвинили Петра в том, что он торгует церковными должностями и освящает браки между близкими родственниками. Тем не менее Петр занял митрополичий престол. Из-за конфликта с Тверью новый митрополит обосновался в Москве. Там же он скончался и был погребен в недостроенном еще Успенском соборе. В Москве вскоре стали почитать Петра как святого. Тверь же навсегда утратила возможность стать духовным центром Руси. Победительницей из этой борьбы вышла Москва.
Другой причиной утраты Тверью позиций стало принятие тверским князем титула «великий князь всея Руси». Прежде только митрополит мог иметь в своем титуле слова «всея Руси». Теперь же, судя по новому титулу, тверской князь — подобно византийскому императору — мог вмешиваться в дела церкви. Наряду с этим такой титул рассматривался и как претензия Твери на подчинение себе всех русских земель. Однако русские князья в то время не стремились к объединению. Даже намек на это в титуле тверского князя оттолкнул их от Твери и сблизил с ее соперницей — Москвой. Кроме того, малые и средние княжества были напуганы растущим военным могуществом Твери. Так Москве досталась роль, которую не смогла сыграть Тверь, — центра последовательного собирания русских земель под единой властью.
В конце лета 1317 г. князь московский Юрий Данилович (1303–1325) сумел выторговать у хана Узбека ярлык на великое княжение. Он обвинил тверского князя в том, что тот якобы отдавал Орде не всю дань и хочет бежать в Ливонию. К этому вскоре добавился еще один повод для преследования князя Михаила Тверского (1282–1218). В ходе военных действий Михаил пленил жену Юрия, сестру хана Узбека Кончаку. Через некоторое время она умерла в Твери, что позволило московскому князю утверждать, что ее будто бы отравил тверской князь. В конце февраля 1318 г. Михаил и Юрий предстали перед ханским судом. В Орде после длительного разбирательства Михаил был убит.
В 1322 г. сыну Михаила тверскому князю Дмитрию удалось получить ярлык на великое княжение. Через три года, встретив в Орде Юрия Московского, который пытался вернуть себе утраченный титул, Дмитрий убил его на глазах хана Узбека. За это через десять месяцев он был казнен. Ярлык на великое княжение получил его брат Александр Тверской. Так в 1326 г. Александр вновь дал Твери шанс занять господствующее положение на Руси. Однако достигнутый им успех оказался недолговечным — ярлык оставался в руках тверского князя всего лишь год.
Позиции Твери, казалось, были окончательно подорваны после подавления в ней восстания против татар (1327). Возглавивший карательный поход на Тверь московский князь Иван Данилович Калита (1325–1340) «людей множество погубиша, а иныа в плен поведоша, а Тверь и вся гради огнем пожгоша». За это Ивану хан даровал ярлык на великое княжение, а вместе с ним — и право собирать дань с русских земель.
Вместе с тем в последней четверти XIV в. начался новый политический, экономический и культурный расцвет Тверского княжества. Ставшее в это время самым влиятельным на северо-востоке, оно переняло роль центра политического равновесия на всем восточноевропейском пространстве.
Политического зенита Тверское княжество достигло при великом князе Борисе Александровиче (1425–1461). Он стал одним из первых, кто получил свой титул вообще без ханского ярлыка. Положение тверского князя укреплялось тем, что великий князь литовский Витовт приходился ему двоюродным дедом.