Имея в виду последнее обстоятельство, которое, вероятно, и было главною причиною избрания Афанасия, могли надеяться, что новый первосвятитель более других в состоянии будет действовать на Иоанна и пользоваться его расположением. Но не прошло года, как увидели, что таким надеждам не суждено оправдаться. Измена князя Андрея Курбского и некоторых других бояр, бежавших в Литву, и вскоре за тем последовавшие вторжения литовцев и крымцев в русские пределы до того усилили подозрительность в Иоанне, что он не считал себя безопасным в самой Москве, и 3 декабря со всем своим семейством и многими приближенными людьми, взяв с собою разные драгоценности, выехал из столицы неизвестно куда. Чрез месяц (3 генваря 1565 г.) из Александровской слободы он прислал митрополиту грамоту, в которой горько жаловался сначала на бояр вместе вообще с служилыми людьми за их постоянные измены и злоупотребления, потом на святителей и все духовенство – за то, что они, соединясь с боярами, вступаются за виновных, покрывают их своим ходатайством пред государем, и наконец объявлял, что, не могши более сносить многих изменных дел, он оставил свое государство и поехал поселиться там, где Бог укажет. Грамота эта имела в Москве потрясающее действие. Все со слезами просили митрополита отправиться к Иоанну и умилостивить его, но потом рассудили, что присутствие митрополита необходимо в столице, оставленной государем, и послали к нему Новгородского архиепископа Пимена с четырьмя другими владыками и несколькими архимандритами, а вслед за ними поехали многие бояре, приказные люди и другие. Иоанн принял духовных и бояр, выслушал их слезные мольбы, повторил свои укоризны боярам и в заключение сказал, что «для отца своего митрополита Афанасия и для своих богомольцев, архиепископов и епископов» соглашается взять свои государства, но с условием, чтобы не препятствовали ему казнить виновных по своему усмотрению и чтобы духовенство не стужало и не претило ему своим ходатайством. Условие, конечно, было принято, и Иоанн, возвратившись в Москву, учредил известную
опричнину со всеми ее безрассудствами, неистовствами и ужасами. Начались казни бояр и невыносимые притеснения всем земским людям от царских опричников. Митрополит и епископы могли скорбеть о несчастных и молиться за них, но не смели ходатайствовать пред государем. Знаем только два исключения: Иоанн, простив знатного вельможу Яковлева и возвратив из ссылки славного своего воеводу Воротынского, четыре года прожившего на Белоозере, сам объявил, что за них были ходатаями митрополит и епископы. Среди тяжких обстоятельств отечества, которые не могли не действовать на дух и на здоровье старца митрополита, Афанасий не замедлил по болезни добровольно оставить свой престол (16 мая 1566 г.), который занимал только два года и два с небольшим месяца, и отошел в Чудов монастырь, где принял некогда монашеское пострижение.