Техническое задание на P-38D предусматривало совершенствование защищенности самолета путем увеличения толщины бронелистов и изменения схемы их размещения. Лобовое бронестекло также было усилено. Начиная с этой модификации на «Лайтнинге» появились протектированные (оклеенные снаружи специальной губчатой резиной, набухавшей при соприкосновении с бензином и предотвращавшей его утечку при боевых повреждениях) бензобаки общей емкостью 1136 л (нормальный запас топлива составлял 795 л). Конструкторы пересмотрели и состав высотного оборудования. Вместо баллонов высокого давления на самолет стали устанавливать сосуды Дьюара с жидким кислородом.
Последние экземпляры истребителей серии D, подобно экспортным английским P-322, получили ленты-обтекатели, закрывавшие стык центральной гондолы с крылом. В кабине устанавливали прицел L-3 компании «Линн Инструмент», а фотокинопулемет перенесли из носка гондолы пилота в левый пилон для подвески бомбы. Дело в том, что на ранних P-38 качество контрольных фильмов сильно страдало из-за вибраций, возникавших при одновременной стрельбе из четырех пулеметов и пушки. На нижней поверхности левой консоли появилась выдвижная фара для ночных полетов.
Самолеты P-38D сходили со сборочной линии с июля по октябрь 1941 г. Эти машины передавались в 1-ю истребительную группу, а также в 14-ю истребительную группу, базировавшуюся в Гамильтон Филд, штат Калифорния. Изменение наименований эскадрилий и групп (прежнее PG — Pursuit Group — группа перехватчиков, а позднее FG — Fighter Group — истребительная группа) произошло в июне 1941 г. одновременно с заменой термина USAAC на USAAF (United States Army Air Force — Военно-воздушные силы Армии США).
Истребители из 1 FG принимали участие в крупномасштабных учениях, проведенных американской армией в сентябре 1941 г. в штатах Луизиана, Северная и Южная Каролина. Самолеты сторон получили специальные опознавательные знаки: белый или красный крест на фюзеляже. Истребители P-38 несли большие кресты на передней части центральной гондолы. В день вступления США во Вторую мировую войну USAAF располагали 69 боеспособными «Лайтнингами».
На Европейском театре войны первую победу в воздухе на истребителе P-38D одержал 14 августа 1942 г. второй лейтенант Эльза Шахан из 27-й истребительной эскадрильи (27 FS — Fighter Squadron). Он добил поврежденный пилотом P-40 немецкий четырехмоторный самолет-разведчик FW-200 «Кондор», отправив последнего на дно Северного моря.
В ноябре 1941 г. был принят к серийному производству первый по-настоящему боеспособный вариант «Лайтнинга» — P-38Е («Модель 222»). Он имел ряд существенных отличий от предшествовавшей ему модификации D. Прежде всего это касалось состава вооружения. Впервые на P-38 вместо 37-мм орудия установили пушку «Испано-Сюиза» HS404, которая производилась фирмой «Бендикс» под обозначением M1 по французской лицензии. Боекомплект пушки состоял из 150 патронов. Конструкцию передней стойки шасси заимствовали у P-322. Это мероприятие вместе с применением несимметричной установки пулеметов, сдвинутых по длине в среднем на 50 мм один относительно другого, позволило увеличить размеры патронных ящиков и довести боекомплект каждого из четырех 12,7-мм пулеметов до 500 патронов.
От ранних вариантов P-38Е отличался также новой радиостанцией SCR-274N. Взамен одного большого воздухозаборника в верхней части балки над крылом были установлены три малых: средний для обогревателя кабины и два крайних для турбокомпрессора. В конструкцию корпуса турбокомпрессора ввели экраны, предотвращавшие попадание оторвавшихся (вследствие аварий или боевых повреждений) лопаток турбин в кабину пилота. На последних машинах модификации E пустотелые стальные лопасти винтов были заменены дюралевыми производства фирмы «Кертисс Электрик». Важным, но малозаметным внешне мероприятием стало изменение соотношения площадей стабилизатора и руля высоты, которое положительно сказалось на управляемости машины. Некоторые «Лайтнинги» модели Е получили подцентропланные бомбодержатели D-820, на каждый из которых можно было подвесить топливный бак емкостью 300 галлонов (1140 л), однако чаще применялись более скромные по емкости 155-галлонные (586 л) или 165-галлонные (625 л).