Про предків майбутнього гетьмана відомо небагато. Перша документальна згадка про них датується 1544 роком, коли польський король Сиґізмунд подарував Михайлові Мазепі за вірну службу хутір в місцевості Васильків (поблизу Білої Церкви) на ріці Кам’янець, яка була притокою ріки Рось. Мабуть, у цій службі далекий родич нашого героя вбачав можливість кар’єрного росту та збагачення, адже мало хто хотів йти на небезпечну, але важливу службу. У ті часи Біла Церква й прилеглі райони були фактично пограниччям зі степом, звідки приходили татари. Тому сюди часто направляли людей для вартової служби. Хутір Мазеп був облаштований як опорний пункт замку, що прикривав один з напрямів можливого нападу ворога. Михайло ніс службу при білоцерківському старості та часто їздив зі своїми людьми в степ на вартування. Паралельно з цим відбувались жваві спроби заселити край, людей з інших регіонів заманювали на поселення різними привілеями. І це, незважаючи на татарську небезпеку, коли люди змушені були «однією рукою тримати чепігу, а іншою — меч», вдавалося, бо вже до кінця XVI ст. хутір Мазеп перетворився на невелике поселення, яке згодом отримало назву Мазепинці.
З розростанням містечок і селищ поблизу Білої Церкви відпала потреба в оборонному будівництві самого хутора. 1574 року Михайло-Микола Мазепа отримав від короля Генриха ІІІ Валуа, який перебував на польському престолі, ще одне поселення — Пасічне на Волині. Імовірно, саме з цього часу Мазепи породичалися з волинським княжим родом Колединських, про що вже 1688 року згадував письменник Іван Орновський у творі «Муза Роксоланська», пишучи, що Іван Мазепа був з роду «давніх княжат Волинських». І саме на білоцерківській службі шляхетський рід Мазеп познайомився з таким явищем, як козацтво, що тоді тільки зароджувалось. Забігаючи наперед, скажемо, що згодом саме Біла Церква, за висловом польських діячів, стала prima sedes (головним осередком) козацтва. Для цього була дуже проста й логічна причина. Доля роду Мазеп дуже схожа на долі інших шляхетських православних сімей, таких як Хмельницькі, Виговські та інші. Високоосвічені, талановиті, з міцними господарствами, вони мали всі шанси і перспективи стати провідниками свого краю. Та польський егоцентризм не давав їм цього зробити. Єдиним виходом було «навернення» в козацтво і його підтримка. Тому й не дивно, що Мазепин рід швидко покозачився і став одним з найвідоміших козачих шляхетських родів.
Та повернемось до Михайла Мазепи. У нього було два сини — Федір і Микола. Федір Мазепа за свою участь у повстаннях Косинського, Наливайка та Лободи був страчений 1596 року, про Миколу відомостей немає. Імовірно, саме він став батьком Адама-Степана Мазепи (в ті часи одна з частин подвійного імені вказувала на батька, але траплялись винятки). Адам-Степан теж мав гарячу кров і брав активну участь у повстанні Остряниці 1638 року, в ході якого вбив польського шляхтича, за що після поразки повстання був засуджений до інфамії (позбавлення шляхетських прав) та смертної кари. Однак вирок не був виконаний, а через деякий час сторони замирились після сплачення компенсації родині вбитого (така практика була досить поширеною). Приблизно в той самий час Адам-Степан одружився з вісімнадцятирічною Марією з Мокієвських, яка теж була знатного роду і, за деякими свідченнями, зіграла певну роль у вирішенні конфлікту з польськими шляхтичами. Справа в тому, що за тогочасними звичаями вбивцю прощали, якщо за нього погоджувалась вийти заміж молода дівчина. Тому фактично своїм вчинком майбутня мати гетьмана України врятувала його батька від загибелі. Десь за рік після одруження народився і герой нашої оповіді.
Сім’я майбутнього гетьмана, відомого чи не на весь світ, була досить освіченою і заможною. Першу освіту, як і багато його однолітків, Іван здобув удома. Цьому сприяла велика освіченість його матері, яка навіть вступила до Луцького Хрестовоздвиженського братства, а згодом стала ігуменею монастиря. Марія Мокієвська відіграла значну роль й у формуванні духовного світу Івана, який змалечку був дуже побожним і ревним захисником православ’я. Ревність до православ’я була настільки сильною в родині, що завадила шлюбу дочки Олександри зі шляхтичем Яном Войнаровським, який був католиком.
Материнський ореол оберігав Мазепу аж до смерті матері, яка сталась напередодні доленосних подій в житті її сина. Але до цього було ще далеко, а поки завдяки статкам сім’ї, яка ще століттям раніше була найбагатшою в околиці, Івана відрядили до найкращого тодішнього навчального закладу на наших теренах — Києво-Могилянської академії. Академія була організована на кшталт провідних європейських вузів. Тут наш герой оволодів основами граматики, риторики, поетики, математики, астрономії, музики, познайомився з класичними творами, які згодом полюбляв цитувати. Саме в Могилянці молодий Мазепа отримав нагоду вчитись у Інокентія Гізеля, Лазаря Барановича та Іоаникія Галятовського. Останній полюбляв читати студентам Нікколо Макіавелі, який був своєрідним виразником «духу епохи». По завершенні навчання Іван недовгий час студіював філософію у столиці Польщі — Кракові, де досконало опанував поетику і риторику, якою пізніше вміло користувався. Згодом він їздив за кордон вчитися на кошти фонду при Краківській академії, створеного шляхтичем Вартоломеєм Новодворським.