Однак відкрито виступити проти цих задумів заважали сумніви. Поки гетьман сумнівався, невдоволення старшини досягло свого піку й виплеснулося у вигляді знаменитого доносу Кочубея. Із Кочубеєм, як ми вже зазначали, відносини були не прості. Зробивши кар’єру за Дорошенка і Самойловича, обидвоє мали великі амбіції, єдине, що їх відрізняло — це походження. «Богат и славен Кочубей», як про нього згодом напише О. С. Пушкін… Він був людиною, яка належала до так званої козацької «шляхти», тож недивно, що під час Коломацького перевороту, одним із найактивніших учасників якого він був, мав усі шанси стати гетьманом або посісти інший значний пост. Але цього не сталось, як ми вже знаємо, і це дуже зачепило станові почуття Кочубея. Проте цього було замало для відкритого виступу проти гетьмана. Замало було й уже хрестоматійної історії за участі його дочки Мотрі, до якої сватався гетьман. На час написання доносів вона (Мотря) вже була у шлюбі з Василем Чуйкевичем й невдале сватання гетьмана вже дещо підзабулось.
То що ж керувало Кочубеєм, коли він хотів організувати скинення гетьмана? Більшість істориків сходяться на одному: Кочубей був лише своєрідним «інструментом», завдяки якому старшина прагнула скинути гетьмана, котрий її не влаштовував. Мазепа, на думку членів старшини, дещо інертно поставився до загрози, яку містили в собі московські плани стосовно реформації українського війська та України загалом.
Таке невдоволення вперше серйозно виявилось ще наприкінці 1706 року, коли низка членів старшини на чолі з миргородським і прилуцьким полковниками висунули вимогу-ультиматум більше морального характеру, та все ж надто показового. Як переповідають, прилуцький полковник сказав Мазепі: «Як мы всегда за душу Хмельницкого всегда Бога молим и имя его блажим, что Украину от ига Ляцкого освободил, так противным способом и мы і діти нашив о вічные роды душу и кости твои будем проклинать, если за гетьманства свого по смерти своїй в такой неволи зоставиш». Таких закликів згодом було ще багато. Гетьман фактично нічого не відповів на них, чим ще дужче розлютив старшину, яка не могла пасивно спостерігати за запущеним в дію процесом руйнування автономії України, що й так була в рази скорочена в порівнянні з тим обсягом прав і привілеїв, що їх закладав ще Хмельницький.
Оскільки Мазепа виявився в очах старшини неспроможним до активних і, що головне, ефективних дій проти царських планів, старшина вирішила вдатись до перевіреного кроку — доносу на гетьмана, що призвів би до його скинення. Ось тут і вийшла на арену постать Кочубея. Звісно, не до кінця зрозуміло, на що сподівалися змовники, адже навіть у випадку, якби Мазепу таки усунули, шансів на полегшення ситуації було б іще менше, ніж за нього, — однак про всі їхні плани ми так і не дізнаємось, скоріше за все.
Про донос відомо доволі багато. Наприклад, відомо, що за доносом стояли впливові люди, які були в опозиції до гетьмана мало не з перших днів його правління. Одним з таких людей був миргородський полковник Данило Апостол, котрий мав беззаперечний авторитет у Гетьманщині як військовий і державний діяч. Пройшовши тривалу військову службу ще за часів Самойловича та прославившись завдяки вдалим боям у Ліфляндії, він мав усі шанси на те, щоб у разі скинення Мазепи посісти його місце.
Власне, доносів було два, причому другий був навіть подвійним: своїх посланців вислав і Кочубей, і його спільник Іван Іскра, якого незадовго до цього сам Мазепа усунув із посади. Рівень доказів «зради» гетьмана був настільки низький, що донос одразу зарахували до категорії наклепів і навіть цар вирішив не брати його до уваги, відклавши до «вільного часу». Головними пунктами звинувачень, які висував Кочубей Мазепі, були такі:
1. Мазепа має зносини з королем Речі Посполитої, основна їхня мета зводиться до умов, на яких козацька Україна пристане під зверхність поляків.
2. Одного разу в Батурині Мазепа очікував на приїзд царя з думкою, що той його заарештує, тому наказав своїм сердюкам у випадку якогось заворушення чи ознак небезпеки для нього стріляти в кожного. Коли ж приїхав не цар, а урядовець Кікін, гетьман розпустив сердюків.