По характеру вторая жена оказалась прямой противоположностью первой. Мария с удовольствием наблюдала за медвежьими потехами, пытками и казнями осужденных. Свирепствовал и ее брат Михаил. Вокруг царя подобрались новые люди (Малюта Скуратов-Вольский, Федор Басманов, Богдан Вольский, Василий Грязной, князь Афанасий Вяземский и др). Они внушили царю мысль о неверности и предательстве Марии. В феврале 1565 И. IV покинул Москву и переехал в Александровскую слободу. Марию Темрюковну с собой не взял, а приставил к ней надежный караул и велел не выпускать из Кремля. По сообщению английского дипломата Горсея: «тем временем он отдалил свою черкесскую жену, постриг ее в монахини и поместил в монастырь». 6 сентября 1569 Мария неожиданно скончалась, по мнению Пискаревского летописца: «а тогда же опоил царицу Марью Черкаскову». Брат же ее, Михаил Темрюкович, по велению И. IV, был посажен на кол.
Современники обвиняли «злонравную» Марию в «порче нрава» царя, вызвавшей массовые репрессии и разгул опричнины. Вскоре царь вновь возжелал жениться. Гонцы разъехались по всему царству и привезли в Москву полторы тысячи девиц. После многомесячных смотрин осталось 24 кандидатки. И. IV выбрал из них дальнюю родственницу Малюты Скуратова Марфу Васильевну Собакину. Венчание состоялось 28 октября 1571 в Троицком соборе Александровской слободы. Почти сразу молодую, ядреную девку, сразила неведомая хворь. Она стала «сохнуть» на глазах, а 13 ноября 1571 отдала богу душу. Как и в первых двух случаях, царь заподозрил отравление и повелел учинить розыск. По его результатам на плаху пошло несколько десятков человек. И. IV утверждал, что не успел вступить в супружеские права, поэтому церковный собор признал его брак с Марфой Собакиной недействительным.
Этот исторический эпизод послужил сюжетом пьесы Л. А. Мея «Царская невеста» (1849). В 1899 Н.А.Римский-Корсаков создал одноименную оперу, которая была экранизирована в 1965. Образ Марфы Собакиной присутствует в пьесе М. А. Булгакова «Иван Васильевич» и в поставленном по ней фильме Л. Гайдая «Иван Васильевич меняет профессию» (1973).
Из числа не успевших еще разъехаться претенденток И. IV отобрал новую невесту – восемнадцатилетнюю Анну Ивановну (по другим данным, Анну Алексеевну) Колтовскую, дочь мелкопоместного дворянина. На совершение этого брака потребовалось особое разрешение церкви. И. IV добился своего, оправдываясь государственной необходимостью и тяготами одинокого отцовства. 29 апреля 1572 церковный собор разрешил ему жениться в четвертый раз. Семейная жизнь продолжалась неожиданно долго – целых три года. А. Колтовская проявила себя очень независимой особой и, даже, пыталась бороться с произволом опричнины. Ее главным недостатком оказалось то, что она не смогла родить наследников. В 1575 И. IV заточил А. Колтовскую в Тихвинский монастырь и насильно постриг в монахини под именем Дарьи. И. IV вспомнил о бывшей жене в своем духовном завещании: отписал город Ростов «с волостми и с пустми, и с селы и со всеми пошлинами», а также четырнадцать сел «с деревнями и со всеми угодьями». В отличие от своих предшественниц, А. Колтовская умерла своей смертью в 1626 или 1627.
Историк Н. И. Костомаров приписывал И. IV еще один весьма непродолжительный брак, который обычно не учитывался в официальных биографиях. В ноябре 1573 безо всякого церковного разрешения И. IV женился на Марии Долгорукой, т.е. фактически стал двоеженцем. В первую же ночь он обнаружил, что невеста «прежде супружества потеряла девство», приказал «затиснуть ее в колымагу, повести на бешеных конях и опрокинуть в воду».