Марию лишили свободы; ее поочередно перевозили из одного замка в другой, из одного поместья в другое. Хотя Елизавета считала ее одной из наиболее опасных фигур в Англии, но многие англичане признавали, что были восхищены ее грациозными манерами, ее ясным умом и ее редкостной красотой. Уильям Сесил, государственный канцлер Елизаветы, отмечал «ее лукавство и чарующее воздействие на всех мужчин»; похожее наблюдение сделал и Николас Уайт, эмиссар Сесила: «У нее была к тому же обольстительная привлекательность, милый шотландский акцент и пытливый ум, оттененные сдержанностью». Но годы шли, она старела, здоровье ее ухудшалось, и она начала терять надежду. Ее тюремщик, сэр Эмиас Паулет, пуританин, оказался неуязвим для ее чар и обращался с ней все более и более сурово.
К 1586 году, после 18 лет заключения, она потеряла все свои привилегии. Ее содержали в Чартли Холле в Стаффордшире, и больше ей не дозволялось лечиться на водах в Бакстоне, которые прежде помогали облегчить ее страдания во время частых приступов ревматизма. Во время своего последнего посещения Бакстона она алмазом начертала на оконном стекле: «Бакстон, чьи теплые воды прославили тебя, наверное, я больше не приеду сюда никогда. Прощай». Похоже, что она подозревала, что ее лишат и той небольшой свободы, которая еще была у нее. Растущие страдания Марии усугублялись действиями ее девятнадцатилетнего сына, короля Шотландии Якова VI. Она всегда надеялась, что в один прекрасный день ее отпустят и она вернется в Шотландию, чтобы разделить власть со своим сыном, которого она не видела с тех пор, как ему исполнился один год. Однако Яков не чувствовал никакой привязанности к своей матери. Его вырастили и воспитали враги Марии, внушившие Якову, что его мать убила его отца, чтобы выйти замуж за своего любовника. Яков презирал ее и боялся, что если она вернется, то постарается захватить его корону.
Ненависть его к Марии наглядно проявилась в том, что он без брезгливости стремился сочетаться браком с Елизаветой I, женщиной, которая виновна в лишении свободы его матери (и которая была старше него на тридцать лет). Елизавета отклонила предложение.
Мария писала своему сыну в надежде склонить его на свою сторону, но письма ее никогда не достигали границ Шотландии. К этому моменту Мария находилась в большей изоляции, чем когда-либо раньше: все письма от нее конфисковывались, а вся входящая корреспонденция задерживалась ее тюремщиком. Мария была совершенно подавлена; казалось, что никакой надежды больше не осталось. И в этом состоянии безысходности 6 января 1586 года она получила поразившую ее пачку писем.
Письма пришли от тех, кто поддерживал Марию на континенте, и их тайно доставил в ее тюрьму Гилберт Гиффорд, католик, покинувший Англию в 1577 году и учившийся на священника в английском колледже в Риме. Вернувшись в 1585 году в Англию и страстно желая быть полезным Марии, он сразу же отправился во французское посольство в Лондоне, где скопилась кипа писем. В посольстве знали, что, если они направят письма обычным путем, Мария никогда не увидит их. Однако Гиффорд объявил, что он сможет тайно переправить письма в Чартли Холл, и он на самом деле сдержал свое слово. Эта передача была одной из многих, и Гиффорд стал курьером, не только передавая письма Марии, но и забирая ее ответы. Он придумал довольно остроумный способ беспрепятственно переправлять письма в Чартли Холл. Он отдавал письма местному пивовару, тот заворачивал их в кожаный мешок, а затем прятал в выдолбленной затычке, которой закупоривали бочонок с пивом. Пивовар доставлял бочку в Чартли Холл, после чего один из слуг Марии вскрывал затычку и передавал содержимое королеве Шотландии. Этот способ действовал равно хорошо и для передачи писем из Чартли Холла.
Тем временем в лондонских тавернах вынашивался план по освобождению Марии. В центре заговора стоял Энтони Бабингтон. Ему всего лишь двадцать четыре, но он уже хорошо известен в столице как красивый, обаятельный и остроумный бонвиван. Чего его многие восхищенные современники не сумели понять, так это того, что Бабингтон был крайне недоволен властями, из-за которых он сам, его семья и его вера подвергались гонениям.