Мария совершила ужасную ошибку. Елизавета не предложила Марии ничего, кроме еще одного заключения. Официальной причиной ее ареста была смерть Дарнли, однако действительная причина состояла в том, что Мария представляла собой угрозу Елизавете, поскольку английские католики считали Марию истинной королевой Англии.
Благодаря своей бабушке, Маргарет Тюдор, старшей сестре Генриха VIII, Мария действительно притязала на английский трон, но у последнего выжившего отпрыска Генриха, Елизаветы I, имелось на него, пожалуй, преимущественное право. Однако Елизавета была объявлена католиками незаконнорожденной, так как являлась дочерью Анны Болейн, второй жены Генриха, после того как он расторгнул брак с Екатериной Арагонской вопреки запрету папы. Английские католики не признавали развода Генриха VIII, они не признавали последующей его женитьбы на Анне Болейн, и они заведомо не считали их дочь Елизавету королевой. Католики рассматривали Елизавету как мерзкого узурпатора.
Марию лишили свободы; ее поочередно перевозили из одного замка в другой, из одного поместья в другое. Хотя Елизавета считала ее одной из наиболее опасных фигур в Англии, но многие англичане признавали, что были восхищены ее грациозными манерами, ее ясным умом и ее редкостной красотой. Уильям Сесил, государственный канцлер Елизаветы, отмечал «ее лукавство и чарующее воздействие на всех мужчин»; похожее наблюдение сделал и Николас Уайт, эмиссар Сесила: «У нее была к тому же обольстительная привлекательность, милый шотландский акцент и пытливый ум, оттененные сдержанностью». Но годы шли, она старела, здоровье ее ухудшалось, и она начала терять надежду. Ее тюремщик, сэр Эмиас Паулет, пуританин, оказался неуязвим для ее чар и обращался с ней все более и более сурово.
К 1586 году, после 18 лет заключения, она потеряла все свои привилегии. Ее содержали в Чартли Холле в Стаффордшире, и больше ей не дозволялось лечиться на водах в Бакстоне, которые прежде помогали облегчить ее страдания во время частых приступов ревматизма. Во время своего последнего посещения Бакстона она алмазом начертала на оконном стекле: «Бакстон, чьи теплые воды прославили тебя, наверное, я больше не приеду сюда никогда. Прощай». Похоже, что она подозревала, что ее лишат и той небольшой свободы, которая еще была у нее. Растущие страдания Марии усугублялись действиями ее девятнадцатилетнего сына, короля Шотландии Якова VI. Она всегда надеялась, что в один прекрасный день ее отпустят и она вернется в Шотландию, чтобы разделить власть со своим сыном, которого она не видела с тех пор, как ему исполнился один год. Однако Яков не чувствовал никакой привязанности к своей матери. Его вырастили и воспитали враги Марии, внушившие Якову, что его мать убила его отца, чтобы выйти замуж за своего любовника. Яков презирал ее и боялся, что если она вернется, то постарается захватить его корону.
Ненависть его к Марии наглядно проявилась в том, что он без брезгливости стремился сочетаться браком с Елизаветой I, женщиной, которая виновна в лишении свободы его матери (и которая была старше него на тридцать лет). Елизавета отклонила предложение.
Мария писала своему сыну в надежде склонить его на свою сторону, но письма ее никогда не достигали границ Шотландии. К этому моменту Мария находилась в большей изоляции, чем когда-либо раньше: все письма от нее конфисковывались, а вся входящая корреспонденция задерживалась ее тюремщиком. Мария была совершенно подавлена; казалось, что никакой надежды больше не осталось. И в этом состоянии безысходности 6 января 1586 года она получила поразившую ее пачку писем.