Памина е избягала от замъка на Зарастро и по следите й е тръгнал нейният пазач — негърът Моностатос. Слугите се радват, че девойката е избягала от техния мъчител Моностатос. Но радостта им е кратка. Негърът е хванал Памина и сега я води обратно. Той заповядва на слугите да оковат девойката.
Моностатос заплашва Памина със смърт. Уплашена, тя изпада в безсъзнание. Моностатос изпъжда слугите, за да остане насаме с девойката. В това време в покоите на Памина се вмъква Папагено. Като вижда негъра, той се вцепенява от страх и иска да побегне. Не по-малко се уплащва и Моностатос от странно облечения ловец на птици и сам бързо офейква. Папагено разказва на Памина кой е, защо е дошъл, а също така и за любовта на Тамино към нея. Той подканя девойката да тръгне бързо с него.
Трите момчета-гении са довели Тамино пред храма на Зарастро: Момъкът веднага се опитва да влезе вътре, но пред принца застава Говорителя — един от жреците, — който му разкрива истината за добротата и мъдростта на Зарастро. Тамино е разколебан: наистина ли Зарастро е първожрецът на любовта и мъдростта; наистина ли Царицата на нощта го е измамила. Преди да реши на коя страна е истината, Тамино, изпълнен с тревога, пита жива ли е Памина. Когато му отговарят, че е жива, той радостно засвирва с флейтата. Щом дочува флейтата, Папагено веднага се обажда със своите звънчета, но двамата се разминават. Идва Папагено с Памина. Тук ги застига злобният Моностатос с робите си. Негърът заповядва да оковат и двамата бегълци, но Папагено засвирва с чародейните звънчета и настръхналите негри веднага се превръщат в кротки и добродушни хорица. Тържествени фанфари известяват пристигането на Зарастро. Памина веднага се приближава до него и искрено му признава, че е искала да избяга, защото се е страхувала от Моностатос. Мъдрият Зарастро оценява искреността и честността на Памина, разбира нейната любов и заповядва Моностатос да бъде наказан. Той отвежда Памина и нарежда Тамино и Папагено да бъдат подложени на изпитание.
Жреците на слънчевото царство са се събрали на съвет. Зарастро, който вярва в нравствените качества на Тамино, предлага принцът да бъде приет сред посветените — тези, които се стремят към мъдрост и добро. Говорителят се колебае. Той не е сигурен в качествата на Тамино, защото си спомня своята първа среща с дръзкия момък. Обаче след настояванията на Зарастро жрецът се съгласява.
Тамино и Папагено са оставени в тъмното преддверие на храма. Двамата ги очаква първото изпитание — страшна буря. Тамино мъжествено устоява на бурята, но мълниите и гръмотевиците измъчват ужасно Папагено. Внезапно идват трите дами, които упрекват Тамино и Папагено в измяна. Дамите със заплаха ги карат да се върнат при Царицата на нощта, но Тамино е непреклонен.
Памина спи в градината. Моностатос се приближава тихо към нея и отново се опитва да я спечели с ласки. Неочаквано се появява Царицата на нощта. Тя изгонва Моностатос и заклева дъщеря си да убие Зарастро. Памина е ужасена. Царицата, разярена от отказа на Памина, я обсипва с проклятия и си отива. Отново се приближава Моностатос. Той със заплахи иска да спечели любовта на Памина. Неочаквано идва Зарастро, който веднага изпъжда наглия негър. Памина иска да оправдае майка си пред Зарастро и го моли да не й отмъщава. Тя постепенно започва да разбира истината в думите на мъдреца.
В друга част на храма Тамино и Папагено очакват второто изпитание. Това е мълчанието. Идват трите момчета-гении, които носят вълшебните инструменти на Тамино и Папагено — флейтата и звънчетата. Освен това те донасят храна. Папагено радостно се хвърля на храната, а Тамино мечтателно засвирва с флейтата. Водена от звуците на флейтата, идва Памина. Тамино обаче стои безмълвен. Тя отчаяна си отива. Зарастро изпраща и при Папагено подобно изпитание. Идва младата и хубава Папагена. Щом я вижда, ловецът на птици се влюбва в нея. Той забравя всичко пред нейната красота и заговорва. Папагено не издържа изпитанието.
Предстои главното изпитание за Тамино. Памина е доведена от Зарастро, за да се сбогува с принца. Тя се безпокои за неговата участ, но Зарастро й внушава смелост. Жреците отвеждат Тамнно, Папагено се отказва от изпитанието и си мечтае за Папагена. Тя идва, но в образа на старица. Увлечена в разказите на Папагено, девойката се показва а истинския си образ, но Папагено още не я заслужава.